筆者最近在整理我國(guó)近年來(lái)間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品的IND注冊(cè)申報(bào)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的企業(yè)開(kāi)始布局干細(xì)胞治療這一賽道。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心（NMPA）僅2023年受理的干細(xì)胞產(chǎn)品就有42項(xiàng)，獲批數(shù)目就達(dá)到24項(xiàng)，還有14個(gè)產(chǎn)品尚在評(píng)審階段。間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品呈井噴式爆發(fā)，與其經(jīng)眾多臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證所展示出的強(qiáng)有力的治療效果和產(chǎn)品的安全性密不可分。而干細(xì)胞產(chǎn)品從工藝探索、藥學(xué)研究再到臨床轉(zhuǎn)化的階段，整體生產(chǎn)流程中需要遵循嚴(yán)格的質(zhì)量控制。本文將干細(xì)胞產(chǎn)品藥學(xué)研究全流程分成主要的三個(gè)階段，按照生產(chǎn)用原材料的采集（組織/細(xì)胞采集），多級(jí)細(xì)胞庫(kù)的制備以及終產(chǎn)品（原液/半成品/制劑）的生產(chǎn)，分階段介紹關(guān)鍵的質(zhì)量研究?jī)?nèi)容，包括過(guò)程中涉及的質(zhì)量評(píng)價(jià)項(xiàng)目、關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)和參考質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)施案例。
一、組織/細(xì)胞采集階段（以臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞為例）：
作為生產(chǎn)用起始原材料，也是整個(gè)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的開(kāi)端，需要嚴(yán)格進(jìn)行供者管理。在臍帶采集前，需簽訂供供者捐獻(xiàn)知情同意書用于倫理審查；在采集臍帶時(shí)，需要篩選供者年齡、無(wú)傳染性疾病、無(wú)遺傳性疾病，在供者健康調(diào)查表中需統(tǒng)計(jì)過(guò)去家族病史與現(xiàn)病史。在采集臍帶的同時(shí)，可以同時(shí)采集產(chǎn)婦靜脈血與臍帶血用于病毒檢測(cè)作為物料入場(chǎng)控制。
在臍帶的采集、運(yùn)輸、接受整個(gè)過(guò)程中需保證無(wú)菌；人源病毒檢測(cè)項(xiàng)主要包括：HIV、HAV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV、HPV、B19、人皰疹病毒6/7/8、人多瘤病毒、腺病毒、SARS-CoV-2等。
本階段檢測(cè)方法多參考藥典法條，無(wú)菌檢測(cè)通常采用藥典法中的需/厭氧菌培養(yǎng)法及薄膜過(guò)濾法。染色體核型檢測(cè)方法為G帶染色。人源病毒檢測(cè)方法通常為凝集法、ELISA或Q-PCR法。
圖1：G帶染色法-染色體核型（正常為46,XX或46,XY）
圖2：STR圖譜分析報(bào)告
本階段質(zhì)量要求：1、無(wú)菌檢查呈陰性2、產(chǎn)婦血病毒為陰性3、染色體核型正常4、STR無(wú)細(xì)胞間交叉污染。
二、關(guān)鍵中間體（多級(jí)細(xì)胞庫(kù)）的制備階段
不同的工藝路線，其關(guān)鍵中間體也有所不同。多數(shù)組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞通常會(huì)建立主細(xì)胞庫(kù)與工作細(xì)胞庫(kù)。在細(xì)胞凍存前會(huì)進(jìn)行放行檢驗(yàn)，只有符合放行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的樣品才可以用于建庫(kù)保存。此時(shí)檢測(cè)項(xiàng)目包括細(xì)胞的生物學(xué)活性（細(xì)胞活率和細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞增殖能力檢測(cè)）、鑒別（細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞表面標(biāo)志物）以及微生物安全性（無(wú)菌檢測(cè)、支原體檢測(cè)、外源病毒檢測(cè)、端粒酶活性與染色體核型檢測(cè)等）。
在細(xì)胞凍存入庫(kù)后，為了保證凍存的細(xì)胞能夠滿足后續(xù)的生產(chǎn)要求，還要抽庫(kù)進(jìn)行更全面的質(zhì)量檢測(cè)。主要檢項(xiàng)包括：生物學(xué)活性（細(xì)胞活率和細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞增殖能力）、細(xì)胞鑒別（細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞表面標(biāo)志物）、生物學(xué)安全性檢查（體外成瘤性、STR、染色體核型、端粒酶活性）、生物學(xué)效能（淋巴細(xì)胞增殖抑制能力、針對(duì)特定適應(yīng)癥體外藥效調(diào)節(jié)）、微生物安全性檢查（無(wú)菌、支原體）等。
與此同時(shí)，考慮到維持各級(jí)細(xì)胞庫(kù)在長(zhǎng)期凍存過(guò)程中的質(zhì)量屬性，需深入研究細(xì)胞庫(kù)的凍存穩(wěn)定性，考察現(xiàn)有凍存條件對(duì)細(xì)胞質(zhì)量的影響，尤其是長(zhǎng)期凍存穩(wěn)定性（時(shí)間點(diǎn)包括3個(gè)月、6個(gè)月、一年甚至更久）。穩(wěn)定性研究期限至少需涵蓋上市前臨床試驗(yàn)期限的要求，考察項(xiàng)目與細(xì)胞庫(kù)全檢檢項(xiàng)相同。
本階段檢測(cè)方法與結(jié)果分析舉例：
1、細(xì)胞形態(tài)觀察
圖3：顯微鏡細(xì)胞形態(tài)觀察：應(yīng)為貼壁、長(zhǎng)梭形、旋渦狀生長(zhǎng)[1]
2、細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)
圖4：“三陽(yáng)五陰”流式表型檢測(cè)[2]：需符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，可擴(kuò)展標(biāo)志物如CD166/CD44/CD133等
3、三系分化能力考察
圖5：成脂、成骨、成軟骨球分化照片[1]
對(duì)于三系分化能力的檢測(cè)通?？勺鋈旧?、Q-PCR法以及WB法鑒定誘導(dǎo)后特異性標(biāo)志物的表達(dá)。推薦提供Q-PCR檢測(cè)特征性基因（成骨：ALP、Runx；成脂：LPL、PPARγ；軟骨球：Collagen II等）代替WB法。
4、細(xì)胞數(shù)量、活率與細(xì)胞群體倍增時(shí)間檢測(cè)
細(xì)胞數(shù)量與活率常使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)或AO/PI雙熒光染色，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活率并讀取細(xì)胞數(shù)，推算細(xì)胞收獲量。
關(guān)于細(xì)胞的增殖能力，主要通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線推算細(xì)胞群體倍增時(shí)間（PDT，Population Doubling Time）。PDT計(jì)算公式= [log2/(lgNt-lgN0)] ×T，公式中T為細(xì)胞達(dá)到平臺(tái)期的培養(yǎng)時(shí)間（96 h）， Nt為t時(shí)間收獲細(xì)胞數(shù)，N0為起始接種細(xì)胞數(shù)。
圖6：細(xì)胞PDT統(tǒng)計(jì)[2]
5、端粒酶活性檢測(cè)
在遺傳學(xué)安全性方面，對(duì)細(xì)胞端粒酶活性的檢測(cè)也很關(guān)鍵。大多數(shù)腫瘤等惡性增殖細(xì)胞具有端粒酶活性，正常的體細(xì)胞中端粒酶常常失活。hTERT亞基的mRNA水平基因表達(dá)量可用來(lái)衡量端粒酶活性。Q-PCR檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性，樣品即合格。
6、MSC免疫調(diào)節(jié)能力
圖7：MSC抑制人淋巴細(xì)胞增殖功能[1]
MSC具有抑制人淋巴細(xì)胞增殖的能力，通過(guò)CFSE標(biāo)記人PBMC活細(xì)胞，隨細(xì)胞分裂熒光強(qiáng)度逐步減半，通過(guò)流式檢測(cè)CFSE熒光強(qiáng)度推算子代與親代細(xì)胞比例，能夠檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。通常將不同濃度的MSC與預(yù)處理激活的PBMC細(xì)胞共培養(yǎng)多天，計(jì)算PBMC細(xì)胞增殖抑制比例。這里需要優(yōu)化共培養(yǎng)試驗(yàn)條件后，測(cè)試多批不同來(lái)源的PBMC，計(jì)算合適的抑制率放行范圍。這里不同來(lái)源的PBMC引起的結(jié)果波動(dòng)比較大，可以對(duì)使用的PBMC批號(hào)做提前篩選，以免影響判定結(jié)果。
圖8：MSC調(diào)節(jié)人淋巴細(xì)胞亞群增殖功能[1]
除抑制淋巴細(xì)胞增殖外，MSC還能夠抑制淋巴細(xì)胞Th1和Th17亞群。
圖9：MSC調(diào)節(jié)人淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力[1]
也可以選擇圖中提供的多種細(xì)胞因子，如發(fā)揮抑炎作用的IL-10，促炎因子TNFα、INFγ等，檢測(cè)MSC對(duì)免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子含量的影響，評(píng)估產(chǎn)品的免疫調(diào)節(jié)能力。
對(duì)細(xì)胞庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（可參考）：
1、生物學(xué)活性：細(xì)胞活率不低于80%，增殖能力細(xì)胞倍增時(shí)間在20-30 h；
2、細(xì)胞鑒別：形態(tài)觀察為長(zhǎng)梭形、成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞表面標(biāo)志物流式結(jié)果應(yīng)滿足ISCT最低檢定標(biāo)準(zhǔn)的CD73/90/105+＞95%，CD19/34/45/11b、HLA-DR+＜2%，具有向成骨、成軟骨、成脂分化能力；
3、生物學(xué)安全性檢查：體外成瘤實(shí)驗(yàn)應(yīng)無(wú)成瘤，STR檢測(cè)無(wú)細(xì)胞間交叉污染，染色體核型正常，端粒酶活性應(yīng)為陰性；
4、微生物安全性檢查：無(wú)菌/支原體檢查應(yīng)為陰性，人源病毒檢測(cè)應(yīng)為陰性；
5、生物學(xué)效能考察：間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞增殖抑制功能應(yīng)為抑制，對(duì)淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子功能應(yīng)為抑制。
三、對(duì)原液和制劑的質(zhì)量控制
對(duì)于終產(chǎn)品的質(zhì)量也需要做全面檢測(cè)。在輔料加入前，對(duì)原液的質(zhì)量檢測(cè)包括：理化性質(zhì)（滲透壓檢測(cè)）、細(xì)胞鑒別（形態(tài)與活率數(shù)量、染色體核型、STR、流式表面標(biāo)志物表型）、生物學(xué)效能（三系分化能力、細(xì)胞因子分泌、免疫抑制能力等）、生物學(xué)安全性（軟瓊脂克隆形成、端粒酶活性）、外源成分殘留（凍存液DMSO、BSA、慶大霉素等）和微生物檢測(cè)（無(wú)菌、支原體、內(nèi)毒素、人源病毒檢測(cè)）。
原液通過(guò)加入輔料以及灌裝后形成制劑。相應(yīng)的檢項(xiàng)在此時(shí)也最為全面，包括理化特性（滲透壓、pH、產(chǎn)品外觀、可見(jiàn)異物及裝量）、細(xì)胞鑒別（形態(tài)與活率數(shù)量、染色體核型、STR、流式表面標(biāo)志物表型、同工酶、STR、細(xì)胞周期、凋亡及衰老、細(xì)胞倍增時(shí)間及克隆形成率等）、生物學(xué)效能（三系分化、細(xì)胞因子分泌、免疫細(xì)胞抑制調(diào)節(jié)和不同疾病細(xì)胞模型的藥效調(diào)節(jié)）、生物學(xué)安全性（軟瓊脂克隆形成、端粒酶活性）、殘留檢測(cè)（DMSO、TrypLE消化酶、殘余培養(yǎng)基）、微生物安全性（支原體、無(wú)菌、厭氧/需氧菌、內(nèi)毒素、人源性病毒檢測(cè)）。作為輸注入人體前的最后一道關(guān)卡，對(duì)制劑的檢項(xiàng)最為全面，能夠保證在臨床應(yīng)用時(shí)的安全性。
這里需要注意，產(chǎn)品與工藝相關(guān)雜質(zhì)可結(jié)合穩(wěn)定合理的工藝清除驗(yàn)證進(jìn)行分析控制。不同工藝過(guò)程中，對(duì)終產(chǎn)品中存在殘留并且可能影響干細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量和安全有效性的工藝相關(guān)雜質(zhì)，例如BSA、消化酶、凍存液成分，或者有些工藝中涉及分選和三維條件下微載體培養(yǎng)等，應(yīng)關(guān)注相關(guān)成分殘留檢測(cè)做為放行控制。
對(duì)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（可參考）：
1、理化：產(chǎn)品外觀應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)，pH范圍在6.0-8.0，滲透壓范圍在1500~2000 mOsmol/kg，可見(jiàn)異物不超限，裝量應(yīng)符合產(chǎn)品規(guī)格；
2、雜質(zhì)：死細(xì)胞比例應(yīng)低于25%，雜細(xì)胞比例＜2%，DMSO含量應(yīng)≤8 ug/mL，消化液含量應(yīng)≤15ng/mL ，培養(yǎng)基殘留量應(yīng)≤0.125mg/mL；
理化和雜質(zhì)為制劑階段增加的檢項(xiàng)，此外對(duì)細(xì)胞鑒別、安全性檢查、生物學(xué)效能的檢測(cè)項(xiàng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與前文對(duì)細(xì)胞庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相同，可參考前文內(nèi)容。
干細(xì)胞生產(chǎn)過(guò)程中不可避免的需要經(jīng)過(guò)傳代，可能會(huì)存在基因組特性的轉(zhuǎn)變，隨著傳代代次增加，其遺傳不穩(wěn)定性風(fēng)險(xiǎn)也越高，也可能造成細(xì)胞異質(zhì)性。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版對(duì)于生物制品穩(wěn)定性試驗(yàn)的指導(dǎo)原則，還需要對(duì)包括傳代穩(wěn)定性、制劑加速與長(zhǎng)期保存穩(wěn)定性、制劑模擬運(yùn)輸條件穩(wěn)定性、聯(lián)合使用穩(wěn)定性等進(jìn)行考察以保證產(chǎn)品質(zhì)量可控。傳代穩(wěn)定性需要明確體外生產(chǎn)限制傳代的代次與臨床上使用的細(xì)胞代次，在確定的工藝代次基礎(chǔ)上繼續(xù)傳代并進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)鑒別與遺傳穩(wěn)定性考察。制劑的加速和長(zhǎng)期保存研究則需要對(duì)制劑在不同取樣時(shí)間（4h、8h、12h、24h等）和溫度環(huán)境（4℃、25℃、37℃避光等條件）考察相關(guān)指標(biāo)。運(yùn)輸穩(wěn)定性研究中，考慮到模擬運(yùn)輸條件、冷鏈保存和使用過(guò)程中的常規(guī)與極端情況等，可以假設(shè)運(yùn)輸過(guò)程為顛簸路面，運(yùn)輸時(shí)間在8-12 h間，且在開(kāi)始運(yùn)輸和運(yùn)輸終點(diǎn)的首尾脫離冷鏈暴露于25℃環(huán)境。還需要進(jìn)行制劑聯(lián)合使用穩(wěn)定性的研究，在制劑制備后到臨床使用期間，按照冷鏈保存-運(yùn)輸-臨床使用等場(chǎng)景，考察整個(gè)過(guò)程對(duì)細(xì)胞的質(zhì)量是否存在影響。藥企還需制定產(chǎn)品上市批準(zhǔn)后的穩(wěn)定性研究計(jì)劃，用來(lái)保證藥品批準(zhǔn)上市后的主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)、原液與制劑的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
四、小結(jié)
本文按照干細(xì)胞產(chǎn)品開(kāi)發(fā)流程，煎蛋梳理了過(guò)程中的關(guān)鍵質(zhì)量研究?jī)?nèi)容，并對(duì)過(guò)程中涉及的質(zhì)控點(diǎn)、評(píng)價(jià)項(xiàng)和可參考的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做了舉例說(shuō)明。細(xì)胞治療產(chǎn)品因?yàn)槿淌褂玫幕畹募?xì)胞，因此對(duì)其安全性、生物學(xué)有效性的考量更加嚴(yán)格。在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程中，深入學(xué)習(xí)藥典和CDE發(fā)布的指導(dǎo)原則將更好的幫助我們開(kāi)發(fā)出穩(wěn)定、有效且安全的產(chǎn)品。
五、參考資料
1、Stem Cell Reviews and Reports DOI/10.1007/s12015-023-10556-8
2、J Mol Med (2017) 95:205–220 DOI 10.1007/s00109-016-1471-7
3、細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）（2017年12月22日發(fā)布）
4、人源干細(xì)胞產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）（2023年4月25日發(fā)布）
5、中國(guó)藥典2020版三部、四部-生物制品穩(wěn)定性試驗(yàn)的指導(dǎo)原則
6、免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）（2022年5月26日發(fā)布）
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