離子色譜法（IC）是利用流動(dòng)相與固定相中的離子進(jìn)行可逆的離子交換，來(lái)分離離子態(tài)化學(xué)物的色譜方法。離子色譜法具有所需樣品量少、專屬性強(qiáng)、靈敏度和準(zhǔn)確度高、自動(dòng)化程度高、 操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于分析各種離子、有機(jī)酸、堿、胺類和糖類物質(zhì)。自從離子色譜法被收載入2010年版《中國(guó)藥典》，其在藥物的分析檢測(cè)領(lǐng)域也得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，如陰陽(yáng)離子(亞硝酸鹽、鹵素離子、硫酸鹽、銨鹽等)、抗生素、中藥材的金屬離子、二氧化硫殘留量、有機(jī)酸的分析檢測(cè)均有離子色譜的身影。這使得離子色譜法與在藥物分析領(lǐng)域通常采用的紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV-Vis）、 高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）以及質(zhì)譜法（MS）等方法形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，尤其是彌補(bǔ)了以上幾種常規(guī)方法在檢測(cè)部分有機(jī)酸、陰陽(yáng)離子等親水性較強(qiáng)的物質(zhì)方面的不足。眾所周知的是，離子色譜法目前在藥物分析領(lǐng)域仍屬于小眾分析技術(shù)，很多研究者甚至沒(méi)有接觸過(guò)此種分析技術(shù)，故本文筆者總結(jié)了一套離子色譜分析方法開發(fā)思路，共包括八大方面，旨在為廣大研究者們提供參考。
一、離子的種類
確定待分析的離子種類是首要前提，這有助于選擇合適的離子色譜柱和優(yōu)化分離條件。如金屬離子、銨根離子等陽(yáng)離子、氨基酸、抗生素及有機(jī)胺類化合物適合采用陽(yáng)離子型交換色譜柱；鹵素離子、亞硝酸根離子、硝酸根離子、硫酸根離子、磷酸根離子等陰離子和有機(jī)酸適合采用陰離子型交換色譜柱；糖類物質(zhì)可采用陰離子型交換色譜柱或?qū)ｉT的糖分析柱（如圖片和圖片），如陳熠熠等圖片建立了離子色譜法分離并測(cè)定蜂蜜中糖類物質(zhì)的方法，他們選取一種陰離子交換柱圖片和兩種糖柱：圖片 和圖片，這三種型號(hào)色譜柱進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)圖片柱的分離度最佳；中藥材及飲片中圖片殘留量通常采用陰離子交換色譜柱，如張燁等圖片采用Dionex Ionpac AS19陰離子分析柱，采用8~40 mmol/L氫氧化鉀溶液進(jìn)行梯度洗脫，電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)，建立了牛黃清胃丸中二氧化硫的殘留量測(cè)定方法；此外，還有一些專用的離子色譜柱，如用于圖片和圖片的專用色譜柱SH-AC-14，用于多聚磷酸鹽的專用色譜柱SH-AC-16。
二、樣品的性質(zhì)和前處理方法
需要考慮樣品的性質(zhì)，如溶解度、電離效率、穩(wěn)定性和可能存在的干擾物等，以便確定采取需要何種前處理方式，比如簡(jiǎn)單的樣品稀釋，還是需要特殊處理，如過(guò)濾、離心、離子交換處理、固相萃取等。一個(gè)典型的例子就是鹵素類化合物中的氟、氯、溴離子的檢測(cè)，由于以上元素大多以有機(jī)物形式存在, 幾乎不能直接檢測(cè)，考慮到鹵素元素的電負(fù)性相對(duì)較高，研究者們大多采用燃燒分解將其轉(zhuǎn)化成陰離子后進(jìn)行測(cè)定。例如，王瑞萍等圖片建立了氧瓶燃燒-離子色譜法測(cè)定塑料中氟、氯、溴三種元素含量的方法。該方法靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度高，適合測(cè)定不同種類塑料藥包材中的鹵素含量。還有研究者們采用過(guò)濾、離心等前處理方式以減小基質(zhì)干擾和提高待測(cè)離子的靈敏度。陸溱偉等圖片采用離子色譜法分析齊拉西酮原料藥中甲磺酸根離子時(shí)用到了離心和過(guò)濾分離。龍四紅等圖片采用離子色譜法測(cè)定酸湯中13種有機(jī)酸時(shí)除用到離心和過(guò)濾外，還用到固相萃取。
三、色譜柱的選擇
色譜柱為離子色譜分析的核心，分離各種待分析物的關(guān)鍵。應(yīng)根據(jù)樣品類型選擇合適的色譜柱。常見(jiàn)的離子色譜柱包括離子交換柱、離子排斥柱和離子對(duì)柱等。
離子交換柱應(yīng)用離子交換的原理，采用低交換容量的離子交換樹脂來(lái)分離離子，主要用于有機(jī)和無(wú)機(jī)陰、陽(yáng)離子的分離，有的也可用于糖類的分離，比如筆者曾在測(cè)定一種注射液中葡萄糖及果糖含量時(shí)，采用的是Waters Sugar-Pak I這種鈣基陽(yáng)離子柱，將葡萄糖與果糖實(shí)現(xiàn)良好分離，分離度在2.0左右。離子交換柱是目前應(yīng)用最廣泛的離子色譜柱。由于離子交換樹脂耐酸堿性強(qiáng)，故離子交換柱可在任何pH范圍內(nèi)使用，另外易再生處理、使用壽命長(zhǎng)；缺點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度差、易溶易脹、易受有機(jī)物污染。
離子排斥柱的原理是以硅膠為載體，將有離子交換基的有機(jī)硅烷與其表面的硅醇基反應(yīng)，形成化學(xué)鍵合型離子交換劑，基于Donnan排斥作用，是利用溶質(zhì)和固定相之間的非離子性相互作用進(jìn)行分離的。它主要用于無(wú)機(jī)含氧酸根和有機(jī)酸的分離，也可以用于醇類、醛類、氨基酸和糖類的分離。筆者在做一種注射液中葡萄糖有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定時(shí)，采用的是Agilent Hi-Plex H色譜柱，葡萄糖和各有關(guān)物質(zhì)的分離度在2.0以上，各有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)限達(dá)到0.5ppm。離子排斥柱的優(yōu)點(diǎn)是柱效高、交換容量高、交換平衡快、機(jī)械強(qiáng)度高，缺點(diǎn)是不耐酸堿、只宜在pH 2-8范圍內(nèi)使用。
離子對(duì)柱的分離機(jī)理是向流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，這些試劑被色譜柱的固定相所保留，然后待測(cè)物質(zhì)進(jìn)入色譜柱后與離子對(duì)試劑進(jìn)行離子交換，利用各待測(cè)物的保留不同實(shí)現(xiàn)分離。此機(jī)理與在液相色譜法的流動(dòng)相中添加緩沖試劑類似。離子對(duì)柱主要用于表面活性陰離子和陽(yáng)離子以及金屬絡(luò)合物的分離。離子對(duì)色譜柱可提高對(duì)待測(cè)物的選擇性，改善保留，但待測(cè)物的保留易受離子對(duì)試劑濃度、流動(dòng)相pH、溫度、有機(jī)溶劑比例等外部因素的干擾，因此采用離子對(duì)色譜柱時(shí)建議對(duì)各個(gè)外部條件做足夠的考察和篩選。
當(dāng)確定了離子色譜柱類型時(shí)，還需要格外注意各個(gè)型號(hào)色譜柱的pH范圍、最大耐受壓力、最高耐受溫度、適用的溶劑、最佳柱效流速等，以避免離子樹脂失效從而導(dǎo)致柱效下降。
四、流動(dòng)相（淋洗劑）的選擇和優(yōu)化
離子色譜法中流動(dòng)相常被稱作淋洗劑。選擇合適的淋洗劑，優(yōu)化淋洗劑組成和pH，可提高離子交換能力和分離效果，并改善待測(cè)物的保留。與反相液相色譜法不同，離子色譜法采用的淋洗劑常為酸、堿、鹽水溶液，而較少添加有機(jī)試劑進(jìn)行洗脫。根據(jù)待測(cè)離子的不同，通常的淋洗劑的選擇原則如下：
4.1 分離弱保留離子的淋洗劑
常見(jiàn)的弱保留離子包括一價(jià)無(wú)機(jī)陰離子（如Fˉ、Clˉ、Br-）、短碳鏈一元羧酸（如甲酸、乙酸）和一些弱解離的組分等。分離弱保留離子常用弱淋洗離子，如圖片、OHˉ、圖片(洗脫能力由強(qiáng)到弱)。圖片在電離或水解作用下容易被轉(zhuǎn)化為圖片，而圖片的淋洗能力較強(qiáng)，不適用于上述弱保留離子，故圖片穩(wěn)定性欠佳。而圖片在溶液中穩(wěn)定，此類淋洗劑是分離弱保留離子的優(yōu)先推薦淋洗劑。
4.2 分離高親和力離子的淋洗劑
對(duì)離子交換樹脂親和力強(qiáng)的離子有兩種：一種是離子電荷數(shù)大的離子，如圖片、圖片和多聚磷酸鹽等，適用于此類離子的淋洗劑有磷酸鹽水溶液；另一種是離子半徑較大、疏水性強(qiáng)的離子，如Iˉ、SCNˉ、圖片、苯甲酸和檸檬酸等。對(duì)于此類離子，推薦方法是在淋洗劑中加入有機(jī)改進(jìn)劑（如甲醇、乙腈和對(duì)氰酚等）或選用親水性色譜柱。有機(jī)改進(jìn)劑的作用主要是減少樣品離子與離子交換樹脂之間的非離子交換作用，占據(jù)樹脂的疏水性位置，減少疏水性離子在樹脂上的吸附，從而縮短保留時(shí)間，減少峰拖尾，并增加檢測(cè)靈敏度。
4.3 分離電荷數(shù)大的離子的淋洗劑
對(duì)于此類離子，常用方法以增加淋洗離子的濃度或選擇強(qiáng)的淋洗離子（如圖片）為主。
離子色譜對(duì)于淋洗劑的選擇首要原則是淋洗離子與待測(cè)離子的親和力接近，即一價(jià)淋洗離子洗脫一價(jià)待測(cè)離子，二價(jià)淋洗離子洗脫二價(jià)待測(cè)離子。淋洗液濃度的改變對(duì)二價(jià)和多價(jià)待測(cè)離子保留時(shí)間的影響大于一價(jià)待測(cè)離子。若多價(jià)離子的保留時(shí)間太長(zhǎng)，增加淋洗液的濃度是較好的方法。另外，還需考慮淋洗劑的pH值帶來(lái)的影響：pH值提高，體系內(nèi)OH-濃度增加，一般情況下待測(cè)離子保留時(shí)間減小，但對(duì)于弱酸、多元酸，pH值提高，電離增加，保留時(shí)間反而增加，如圖片、圖片。
五、流速、柱溫和梯度程序的優(yōu)化
確定了淋洗劑后，選擇合適的流速、柱溫和梯度洗脫程序，以便獲得良好的分離度和柱效，并提高分離效率和分析速度。與液相色譜優(yōu)化方法相同，有時(shí)等度洗脫存在出峰較晚、保留時(shí)間較長(zhǎng)、峰展寬等問(wèn)題，此時(shí)可考慮提高流速、提高柱溫或更改為梯度洗脫，比如龍四紅等圖片采用離子色譜法測(cè)定酸湯中13種有機(jī)酸時(shí)，采用的是梯度洗脫，并對(duì)流速進(jìn)行過(guò)考察。結(jié)果表明，流速為1.5 ml/min（最高流速）時(shí)既可保證分離度，又可縮短分析時(shí)間。
六、檢測(cè)器的選擇和校準(zhǔn)
離子色譜常用的檢測(cè)器包括電導(dǎo)池檢測(cè)器（直接電導(dǎo)和抑制電導(dǎo)）、電化學(xué)檢測(cè)器（直流安培、脈沖安培和積分安培）和光學(xué)檢測(cè)器（紫外-可見(jiàn)和熒光）等。應(yīng)根據(jù)離子的類型、性質(zhì)和濃度范圍選擇合適的檢測(cè)器。電導(dǎo)池檢測(cè)器是最常用的檢測(cè)器，適用于大多數(shù)離子，尤其是抑制電導(dǎo)常為首選檢測(cè)方式。電化學(xué)檢測(cè)器通常用于能夠在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)的一類離子，比如硫酸根、氰根、亞硝酸根、金屬離子等，也適用于糖類、糖醇和抗生素的分析。王彩媚等圖片建立離子色譜法同時(shí)測(cè)定阿拉伯膠經(jīng)酸水解后的單糖（鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖）和糖醛酸（D-葡萄糖醛酸），采用的是積分安培檢測(cè)器，該方法靈敏度和準(zhǔn)確度高、重復(fù)性良好。此外，電化學(xué)檢測(cè)器的高靈敏度也適用于抗生素的分析，如徐艷梅等[7]建立了離子色譜法測(cè)定阿奇霉素中殘留的鹽酸羥胺，采用電化學(xué)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，鹽酸羥胺的檢測(cè)限和定量限分別為0.062 ng/mL和0.207 ng/mL，具有較高的靈敏度。光學(xué)檢測(cè)器與離子色譜聯(lián)用可提高待分析物的靈敏度，比如離子色譜與紫外檢測(cè)器聯(lián)用，可進(jìn)一步增強(qiáng)待分析物的紫外吸收能力，對(duì)于自身缺少紫外吸收的離子有較好的分析適用性和檢測(cè)靈敏度，目前在硝酸根和亞硝酸根離子的測(cè)定方面得到一定的應(yīng)用。比如，甘露等圖片建立了離子色譜-紫外檢測(cè)器測(cè)定食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的分析方法, 亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢測(cè)限分別為0.0045 mg/L和0.0172 mg/L，該方法簡(jiǎn)便、靈敏，可用于測(cè)定食品中痕量的亞硝酸鹽和硝酸鹽。
無(wú)論采用何種檢測(cè)器，都應(yīng)定期對(duì)其進(jìn)行校準(zhǔn)和性能測(cè)試，以確保樣品測(cè)試時(shí)準(zhǔn)確可靠。
七、離子色譜與其他分析技術(shù)聯(lián)用
有時(shí)候單獨(dú)使用離子色譜無(wú)法滿足測(cè)試需求，此時(shí)可考慮與其他分析技術(shù)聯(lián)用，比如，采用離子色譜與ICP-MS或ICP 聯(lián)用的方法可以對(duì)一些特定元素的價(jià)態(tài)、形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。這種檢測(cè)方式可以解決元素價(jià)態(tài)、形態(tài)問(wèn)題，是單獨(dú)使用原子光譜或離子色譜無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。王媛等圖片建立了IC－ICP-MS方法用于測(cè)定人體尿液中碘元素形態(tài)及含量。該方法可對(duì)圖片和I-定量測(cè)定。另外，還有研究者采用IC－ICP-MS法實(shí)現(xiàn)了對(duì)飲用水中三價(jià)鉻和六價(jià)鉻的含量測(cè)定圖片。離子色譜與原子光譜的聯(lián)用技術(shù)擴(kuò)大了二者的應(yīng)用范圍。
八、方法驗(yàn)證和質(zhì)量控制
與其他定量分析方法一樣，離子色譜分析方法建立后必然需要進(jìn)行方法驗(yàn)證，驗(yàn)證指標(biāo)包括專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性與范圍、耐用性等，微量和痕量分析還需驗(yàn)證檢測(cè)限/定量限，具體驗(yàn)證方法和要求可參照《中國(guó)藥典》四部指導(dǎo)原則9101、USP<1225>和ICH Q2等指南圖片。當(dāng)方法驗(yàn)證成功后，就可用于樣品的質(zhì)量控制，基于分析方法全生命周期監(jiān)控理念，后期的樣品測(cè)試過(guò)程中仍需根據(jù)測(cè)試結(jié)果持續(xù)監(jiān)控方法的穩(wěn)定性和可靠性。
九、結(jié)語(yǔ)
本文筆者從8個(gè)方面，層層遞進(jìn)地闡述了一套離子色譜分析方法開發(fā)思路，意在為廣大研究者在離子色譜分析方法開發(fā)方面提供參考。離子色譜法可以彌補(bǔ)氣相色譜法(GC)和液相色譜法(HPLC)對(duì)離子型藥物等進(jìn)行分析時(shí)的不足，也可以解決ICP或ICP-MS無(wú)法測(cè)試元素形態(tài)、價(jià)態(tài)的問(wèn)題。隨著離子色譜柱種類的不斷增多，色譜柱柱效越來(lái)越好，淋洗劑種類越來(lái)越多，檢測(cè)器類型更佳豐富多樣，未來(lái)離子色譜法在藥物領(lǐng)域的應(yīng)用范圍定會(huì)越來(lái)越廣，期待廣大研究者們開發(fā)出越來(lái)越多的離子色譜分析方法。
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