1、背景
生物類似藥，是指在質(zhì)量、安全性和有效性方面與已獲準(zhǔn)上市的參照藥具有相似性的治療性生物制品[1]。其中的相似性，是指候選藥與已獲準(zhǔn)注冊的參照藥整體相似，且在質(zhì)量、安全性及有效性方面不存在有臨床意義的差別[2]。這部分的定義，在中美法規(guī)指南中基本一致。是否存在臨床意義的差別，是相似性評(píng)價(jià)的考察點(diǎn)。
早在2015年，美國FDA的兩份指導(dǎo)原則[3][4]和中國國家藥監(jiān)局的指導(dǎo)原則[1]提出，可采用遞進(jìn)式的方式證明候選藥與參照藥的相似性，并且提示需要在藥學(xué)質(zhì)量相似性研究中考慮各質(zhì)量屬性與臨床的相關(guān)性，甚至應(yīng)根據(jù)各質(zhì)量特性與臨床效果相關(guān)的程度確定評(píng)判相似性的權(quán)重，并設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。
2017年，美國FDA發(fā)布指導(dǎo)原則草案[5]，提出應(yīng)采用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具，評(píng)估產(chǎn)品質(zhì)量屬性對(duì)臨床的潛在影響，并將質(zhì)量屬性分為三個(gè)級(jí)別，臨床相關(guān)性最強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)最高的質(zhì)量屬性為第一級(jí)（Tier 1，通常是生物學(xué)活性方法），風(fēng)險(xiǎn)更低的為第二級(jí)（Tier 2），風(fēng)險(xiǎn)最低的為第三級(jí)（Tier 3），并且給出了每個(gè)級(jí)別所推薦使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析工具，Tier 1使用等效性檢驗(yàn)（Equivalence testing），Tier 2使用質(zhì)量范圍（Quality ranges）評(píng)估，Tier 3可采用直觀對(duì)比（Visual comparisons）的方式。雖然該指導(dǎo)原則草案在公示不到一年的時(shí)間就被FDA撤回，不過撤回的原因主要是業(yè)界反饋認(rèn)為，指南中要求參照藥及生物類似藥的批次數(shù)量、統(tǒng)計(jì)學(xué)的評(píng)估方法影響了生物類似藥開發(fā)的成本和效率，而其中提出的基于臨床影響的質(zhì)量屬性分級(jí)思想依然被業(yè)界所廣泛接受。
2019年，F(xiàn)DA發(fā)布指導(dǎo)原則草案[6]，重新提出了對(duì)生物類似藥質(zhì)量相似性數(shù)據(jù)分析的建議，認(rèn)為對(duì)于高到中等風(fēng)險(xiǎn)的質(zhì)量屬性，可以使用質(zhì)量范圍的方法進(jìn)行評(píng)估，對(duì)于低風(fēng)險(xiǎn)或無法定量的質(zhì)量屬性采用直觀對(duì)比的方式進(jìn)行。同時(shí)提到，不推薦使用容忍區(qū)間作為相似性的接受標(biāo)準(zhǔn)（因?yàn)楂@得有意義的區(qū)間需要較大的樣本量），但可以使用其他統(tǒng)計(jì)方法，如等效性檢驗(yàn)。
2021年，中國國家藥監(jiān)局發(fā)布了《生物類似藥相似性評(píng)價(jià)和適應(yīng)癥外推技術(shù)指導(dǎo)原則》，在之前指導(dǎo)原則的基礎(chǔ)上，明確了應(yīng)“基于對(duì)參照藥質(zhì)量屬性的認(rèn)知程度及其與臨床風(fēng)險(xiǎn)獲益的相關(guān)性，采用合適的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具對(duì)質(zhì)量屬性進(jìn)行分級(jí)”，并且，“質(zhì)量相似性定量評(píng)估引入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法有助于增強(qiáng)相似性判斷的客觀性”，推薦使用質(zhì)量范圍（μR-XσR, μR+XσR）和直觀對(duì)比的方式進(jìn)行，“對(duì)于和產(chǎn)品作用機(jī)制或臨床表現(xiàn)直接相關(guān)的質(zhì)量屬性（如生物學(xué)活性），可根據(jù)質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)和相似性評(píng)價(jià)目標(biāo)，采用其他統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，如等效性檢驗(yàn)。”
時(shí)至今日，在實(shí)際操作中，藥學(xué)部分的質(zhì)量相似性評(píng)價(jià)依然有一些矛盾和挑戰(zhàn)，大家往往會(huì)被諸如參照藥不同原液批次的收集、代表性樣品的批次數(shù)量、實(shí)施中的統(tǒng)計(jì)工具、判斷相似的可接受標(biāo)準(zhǔn)等等問題困擾。本文即圍繞統(tǒng)計(jì)工具和可接受標(biāo)準(zhǔn)這一點(diǎn)進(jìn)行探討，以加深對(duì)工具的理解，幫助具體的應(yīng)用。這些統(tǒng)計(jì)工具不僅應(yīng)用于質(zhì)量相似性評(píng)價(jià)中，而且能夠廣泛地應(yīng)用在變更可比性研究、技術(shù)轉(zhuǎn)移、分析方法對(duì)比、維護(hù)乃至樣品檢測等各個(gè)方面。
圖 1 Stepwise approach to demonstrating biosimilarity
2、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和分級(jí)
質(zhì)量相似性評(píng)價(jià)指標(biāo)通常包括蛋白結(jié)構(gòu)和理化特性、純度和雜質(zhì)、生物學(xué)活性、免疫學(xué)特性、穩(wěn)定性等[2]。質(zhì)量屬性的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可以采用多種風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具進(jìn)行（如RPN風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先順序數(shù)評(píng)估、RRA風(fēng)險(xiǎn)排序分析法等等），但至少需要包含如下兩個(gè)方面[6]：
對(duì)臨床表現(xiàn)的潛在影響：包括活性、PK/PD、安全性、有效性和免疫原性，可以通過公開可獲得的信息，或自行對(duì)參照藥進(jìn)行的相關(guān)表征研究獲得信息。
圍繞某一質(zhì)量屬性的不確定程度：如質(zhì)量屬性與臨床表現(xiàn)之間的相關(guān)性存在不確定性時(shí)，其質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)評(píng)估為更高的等級(jí)。
穩(wěn)定性比對(duì)研究（例如穩(wěn)定性或強(qiáng)制降解研究中的降解速率等）可不必進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)，但應(yīng)體現(xiàn)在質(zhì)量相似性評(píng)價(jià)中。
3、Tier 1 (Equivalence testing) 等效性檢驗(yàn)
對(duì)于和產(chǎn)品作用機(jī)制或臨床表現(xiàn)直接相關(guān)的質(zhì)量屬性（如生物學(xué)活性），被分類為Tier 1，推薦使用等效性檢驗(yàn)方法進(jìn)行評(píng)估（也可使用質(zhì)量范圍方式進(jìn)行評(píng)估）。FDA撤回指南[5]的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估方面的原因也主要在等效性檢驗(yàn)方面[7]。
自2014年起，F(xiàn)DA就開始通過PINDs和INDs的會(huì)議意見向申辦方推薦等效性檢驗(yàn)的方法[7]。從技術(shù)角度而言，等效性檢驗(yàn)是目前用來判斷二者是否等效的首選方法。我們常用差異性檢驗(yàn)（如t檢驗(yàn)）來評(píng)估兩組數(shù)據(jù)的均值差異，但是當(dāng)兩組數(shù)據(jù)的均值差異沒有統(tǒng)計(jì)顯著性時(shí)（如p值大于0.05），我們只能得到兩組數(shù)據(jù)差異不顯著的結(jié)論，而無法得到兩組數(shù)據(jù)等效的結(jié)論。等效性檢驗(yàn)?zāi)軌蚝芎玫亟鉀Q這個(gè)問題。此外，等效性檢驗(yàn)不僅計(jì)算了差異的大小，還考慮了差異的意義，從而得到等效與否的結(jié)論。
簡單地說，等效性檢驗(yàn)是一種假設(shè)檢驗(yàn)，它通過假設(shè)參照藥質(zhì)量屬性的均值μR，與候選藥質(zhì)量屬性的均值μT，二者之間的差異μT-μR，應(yīng)在一個(gè)能夠被接受的范圍內(nèi)（或者說在一個(gè)被認(rèn)為是沒有臨床影響的范圍內(nèi)），即等效界值δ，其假設(shè)為：
● H0: μT-μR ≤ -δ or μT-μR ≥ δ
● Ha: -δ < μT-μR < δ
該假設(shè)也可以寫成一種等價(jià)形式：
● H01: μT-μR ≤ -δ vs. Ha1: μT-μR > -δ
● H02: μT-μR ≥ δ vs. Ha2: μT-μR < δ
因此，等效性檢驗(yàn)可以通過兩種方式進(jìn)行，一種是計(jì)算μT-μR差值的90%置信區(qū)間（α=0.05），當(dāng)?shù)刃Ы缰低耆眯艆^(qū)間時(shí)，等效性成立，另一種是進(jìn)行雙單邊t檢驗(yàn)（TOST），在-δ和δ兩側(cè)分別進(jìn)行單邊t檢驗(yàn)（α=0.05），當(dāng)兩個(gè)p值均小于0.05時(shí)，說明等效性成立。兩種方法完全等價(jià)。
圖2 左：等效性檢驗(yàn)將差值的90%置信區(qū)間與等效界值進(jìn)行對(duì)比；右：t 檢驗(yàn)與等效性檢驗(yàn)的結(jié)果對(duì)比
大部分統(tǒng)計(jì)分析軟件都具備計(jì)算等效性檢驗(yàn)相關(guān)統(tǒng)計(jì)量的功能，甚至使用Excel或者手動(dòng)即可進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算。統(tǒng)計(jì)計(jì)算本身不是很大的問題，最大的問題通常在于等效界值的設(shè)置（即可接受標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)置）和樣本量的確定。
等效界值的設(shè)置對(duì)等效性檢驗(yàn)來說是最困難且最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。理想情況下，可以基于科學(xué)知識(shí)或過往經(jīng)驗(yàn)預(yù)設(shè)一個(gè)生物學(xué)意義或臨床意義的等效界值，但受到藥物研發(fā)階段等的限制，通常無法實(shí)現(xiàn)。因此，F(xiàn)DA建議基于參照藥標(biāo)準(zhǔn)偏差σR，采用f×σR作為等效界值，在建議批次數(shù)量n ≥ 10的條件下，為滿足檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α=0.05）和檢驗(yàn)效能（power ≥ 85%），F(xiàn)DA認(rèn)為f取值為1.5是比較合適的[5]，即δ = 1.5×σR。
值得注意的是，F(xiàn)DA的以上建議，是基于以下假設(shè)進(jìn)行的：
假設(shè)均值的真實(shí)差異與σR成正比，即μT-μR與σR成正比；
σR通過參照藥樣品檢測值的標(biāo)準(zhǔn)偏差獲得（一個(gè)批次有一個(gè)檢測結(jié)果）；
為獲得期望的等效性檢驗(yàn)的檢驗(yàn)效能，F(xiàn)DA進(jìn)一步建議在μT-μR = 1/8σR的假設(shè)下，計(jì)算樣本量。
基于均值的真實(shí)差異為1/8σR和檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05的前提下，批次數(shù)量、檢驗(yàn)效能及f的取值有如下關(guān)系[8]：
然而，上述假設(shè)引起了業(yè)界和學(xué)術(shù)界的大量討論，其結(jié)論是值得商榷的。
在使用該種方法時(shí)，由于參照藥質(zhì)量屬性的總體標(biāo)準(zhǔn)差σR未知，需要從已有樣品的檢測中獲得（即用樣品標(biāo)準(zhǔn)差s替代總體標(biāo)準(zhǔn)差σ），而參照藥的產(chǎn)品批次來源在本質(zhì)上是未知的，參照藥批次間的相關(guān)性（如不同參照藥批次可能來自同一原液批次）直接影響了相似性評(píng)價(jià)的設(shè)計(jì)和評(píng)估[7]。也有研究指出[9][10]，在進(jìn)行等效性檢驗(yàn)時(shí)，通過計(jì)算樣品標(biāo)準(zhǔn)差s作為總體標(biāo)準(zhǔn)差σR，并在假設(shè)檢驗(yàn)中視之為常數(shù)，以此在正態(tài)分布假設(shè)中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算，會(huì)導(dǎo)致第一類錯(cuò)誤（Type I error，即等效性檢驗(yàn)中結(jié)果符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，但實(shí)際上不符合）的概率膨脹，并使檢驗(yàn)效能（power）下降[11]。
為了降低這種不良影響，一種替代的方式是將σR作為參數(shù)，然后使用Wald檢驗(yàn)，將Wald統(tǒng)計(jì)量應(yīng)用于等效性檢驗(yàn)的假設(shè)中[5][11]。在這種方法下，為滿足檢驗(yàn)效能大于85%，在產(chǎn)品批次數(shù)量n=10并假設(shè)產(chǎn)品變異性相等時(shí)，f的取值應(yīng)從1.5提高至1.7（即 δ = 1.7×σR）。
另外，參照藥和候選藥批次數(shù)量的不均等，也會(huì)提高第一類錯(cuò)誤的概率并影響檢驗(yàn)效能。對(duì)此，除了推薦批次數(shù)量不小于10以外，通常也建議參照藥和候選藥的批次數(shù)量比例在2/3至3/2之間[12]。當(dāng)批次數(shù)量的不均等非常明顯的時(shí)候，可采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行調(diào)整[13]。在滿足檢驗(yàn)水準(zhǔn)、檢驗(yàn)效能的前提下，上述計(jì)算假定σT ≈ σR，實(shí)際評(píng)估中，對(duì)于固定的候選藥批次數(shù)量，當(dāng)參照藥的變異性大于等于候選藥的變異性時(shí)，參照藥的最小批次數(shù)量可以小于等于候選藥批次數(shù)量，而當(dāng)候選藥的變異性大于等于參照藥的變異性時(shí)，參照藥的最小批次數(shù)量則需要大于等于候選藥批次數(shù)量，在這種情況下，甚至存在參照藥批次數(shù)量無法滿足2/3至3/2候選藥批次數(shù)量的可能。
而且，通常來說，被歸類為Tier 1的關(guān)鍵質(zhì)量屬性一般會(huì)少于4個(gè)。當(dāng)Tier 1質(zhì)量屬性只有一個(gè)的時(shí)候，相關(guān)的樣本量和檢驗(yàn)效能計(jì)算可按上述討論進(jìn)行，而當(dāng)有不止一個(gè)Tier 1質(zhì)量屬性的時(shí)候，這些質(zhì)量屬性之間通常是具有相關(guān)性的，那么，通過多個(gè)等效性檢驗(yàn)的檢驗(yàn)效能計(jì)算會(huì)更為復(fù)雜[13]。檢驗(yàn)效能的計(jì)算，同時(shí)也與樣本量的計(jì)算有關(guān)，因?yàn)榈刃詸z驗(yàn)的參照藥樣本量 k，會(huì)受到以下幾個(gè)參數(shù)的影響：1. 檢驗(yàn)的總I類錯(cuò)誤率（α）；2. II類錯(cuò)誤率（β，即等效性檢驗(yàn)中結(jié)果不符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，但實(shí)際上符合的概率）或者說檢驗(yàn)效能power（1-β）；3. 臨床或科學(xué)有意義的差異（μT-μR）；4. 參照藥的變異性σR（假定σT ≈ σR）。樣本量k即上述參數(shù)的函數(shù)，k = f（α, β, μT-μR, σR）[14]。對(duì)于檢驗(yàn)效能，通常設(shè)定不低于80%，當(dāng)進(jìn)行樣本量調(diào)整時(shí)，建議調(diào)整后的檢驗(yàn)效能也不低于80%。
基于實(shí)際的相似性評(píng)價(jià)場景，只要能夠進(jìn)行適當(dāng)?shù)目剂亢驮u(píng)估，等效性檢驗(yàn)的可接受標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置仍有探討的空間。
圖 3 等效性檢驗(yàn)示例（統(tǒng)計(jì)量計(jì)算表格、散點(diǎn)圖及結(jié)果的可視化呈現(xiàn)，其中，PFE為擬申報(bào)的生物類似藥，EU和US分別為不同地區(qū)的參照藥）[15]
4、Tier 2 (Quality range) 質(zhì)量范圍
對(duì)于風(fēng)險(xiǎn)高至中等的質(zhì)量屬性，可采用質(zhì)量范圍的方式進(jìn)行評(píng)估。中美指導(dǎo)原則[2][6]中均有類似描述，質(zhì)量范圍即（μR-XσR, μR+XσR），其中μR為參照藥質(zhì)量屬性的平均值，σR為其標(biāo)準(zhǔn)偏差，系數(shù)X的設(shè)定應(yīng)根據(jù)質(zhì)量屬性的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)進(jìn)行科學(xué)論證。只要有足夠數(shù)量的候選藥批次數(shù)據(jù)（如90%以上）落在質(zhì)量范圍內(nèi)，即可認(rèn)為該質(zhì)量屬性與參照藥相似（highly similar）。此外，F(xiàn)DA建議，對(duì)于風(fēng)險(xiǎn)更高的質(zhì)量屬性，應(yīng)設(shè)置更窄的質(zhì)量范圍進(jìn)行評(píng)估。
質(zhì)量范圍評(píng)估相似性的統(tǒng)計(jì)邏輯容易理解，不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卣f，質(zhì)量范圍即參照藥質(zhì)量屬性的分布范圍，在正態(tài)分布的假設(shè)下，當(dāng)X=3時(shí)，質(zhì)量范圍即參照藥質(zhì)量屬性的均值±3SD的范圍，即大約是參照藥質(zhì)量屬性的99.7%的數(shù)據(jù)所在的范圍。在假設(shè)μT ≈ μR，σT ≈ σR的前提下，如果候選藥的質(zhì)量屬性數(shù)據(jù)也落在同一個(gè)范圍內(nèi)，說明二者很可能服從同一個(gè)正態(tài)分布，因此可以說明二者的相似性。
我們知道，基于樣本數(shù)據(jù)來推測指定比例的總體所在的統(tǒng)計(jì)概率區(qū)間，通常使用的是容忍區(qū)間的方法。這里僅使用正態(tài)分布的范圍進(jìn)行總體數(shù)據(jù)范圍的推測，而未使用容忍區(qū)間進(jìn)行總體數(shù)據(jù)范圍推測，估計(jì)也與FDA不推薦容忍區(qū)間的原因類似。當(dāng)數(shù)據(jù)量較少的時(shí)候，容忍區(qū)間會(huì)得到很寬的接受范圍，這個(gè)范圍也許并不能產(chǎn)生足夠的意義，反而增加過高的通過機(jī)會(huì)（注意，這不代表可比性研究中不能使用容忍區(qū)間，需要考慮使用條件）。
對(duì)于X的取值，在2015年的杜克大學(xué)工業(yè)統(tǒng)計(jì)研討會(huì)上，一位FDA的發(fā)言者指出，X應(yīng)選擇2~3之間的數(shù)值[13]。在正態(tài)分布的假設(shè)下，即代表有95%（當(dāng)X=2）至99.7%（當(dāng)X=3）的均值數(shù)據(jù)落在范圍內(nèi)。
圖4 正態(tài)分布示例
當(dāng)然，上述的檢驗(yàn)并不完全嚴(yán)謹(jǐn)。首先，我們只能使用有限批次的參照藥質(zhì)量屬性檢測結(jié)果的均值（x-bar）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）來代表總體的均值（μ）和標(biāo)準(zhǔn)差（σ），雖然樣品標(biāo)準(zhǔn)差（s）是總體標(biāo)準(zhǔn)差（σ）的無偏估計(jì)，但確實(shí)缺少了對(duì)參照藥相關(guān)變異性的考量，當(dāng)批次數(shù)量有限的時(shí)候，這個(gè)問題會(huì)更為明顯。其次，雖然指導(dǎo)原則[2][6]中也提及，需要關(guān)注參照藥與候選藥的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的異同，但在實(shí)際評(píng)估中，我們通常無法確保μT ≈ μR，σT ≈ σR（畢竟我們只能獲得 x-bar和s，而非μ和σ），只能基于數(shù)據(jù)是否滿足可接受標(biāo)準(zhǔn)這一結(jié)果來判斷相似或不相似，當(dāng)出現(xiàn)μT = μR，σT ≠ σR，或μT ≠ μR，σT = σR，或 μT ≠ μR，σT ≠ σR的情況時(shí)，其結(jié)果可能會(huì)產(chǎn)生誤導(dǎo)且變得不可靠。
圖5 參照藥和候選藥不同分布情形的圖形化示例 (A) μT = μR，σT ≠ σR, (B) μT ≠ μR，σT = σR, (C) μT ≠ μR，σT ≠ σR.
圖6 質(zhì)量范圍示例 (mean±3×SD，以散點(diǎn)圖形式的可視化呈現(xiàn)，其中，PFE為擬申報(bào)的生物類似藥，EU和US分別為不同地區(qū)的參照藥) [15]
5、Tier 3 (Visual comparisons) 直觀對(duì)比
對(duì)于風(fēng)險(xiǎn)低或者無法定量的質(zhì)量屬性，可采用直觀對(duì)比的方式進(jìn)行評(píng)估。部分質(zhì)量屬性，如蛋白序列、高級(jí)結(jié)構(gòu)等，也不適用于定量分析，通常也是用直觀對(duì)比的方式進(jìn)行。類似的不適用內(nèi)容，需要進(jìn)行清晰的規(guī)定，并進(jìn)行合理化說明。
對(duì)Tier 3的質(zhì)量屬性，可以對(duì)實(shí)際檢測數(shù)據(jù)以恰當(dāng)?shù)姆绞剑ㄈ缟Ⅻc(diǎn)圖）進(jìn)行直觀對(duì)比。從已公開的各家生物類似藥文章和FDA申報(bào)資料來看，原始圖譜和散點(diǎn)圖是被最廣泛采用的形式，不僅是在直觀對(duì)比中，也在等效性檢驗(yàn)及質(zhì)量范圍的評(píng)估中（這也是FDA指南[6]中推薦的，對(duì)于Tier 1和Tier 2的質(zhì)量屬性，也需要進(jìn)行可視化的展示，以呈現(xiàn)參照藥和候選藥產(chǎn)品的質(zhì)量分布）。
原始數(shù)據(jù)和圖像化的呈現(xiàn)，不僅主觀，而且可能有偏向性。顯然，Tier 1的等效性檢驗(yàn)和Tier 2的質(zhì)量范圍評(píng)估都比Tier 3的直觀對(duì)比更為嚴(yán)格。能夠通過Tier 1和Tier 2的檢驗(yàn)，一定能通過Tier 3的檢驗(yàn)。而對(duì)于等效性檢驗(yàn)和質(zhì)量范圍評(píng)估而言，通過Tier 1的檢驗(yàn)并不代表能夠通過Tier 2的檢驗(yàn)，反之亦然[14]。
圖7 直觀對(duì)比示例 (通過CD、FT-IR和DSC進(jìn)行的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析) [17]
6、分析方法
分析方法是質(zhì)量相似性評(píng)價(jià)的基石，只有可靠的檢測結(jié)果才能支持進(jìn)行可靠的相似性評(píng)價(jià)。
指導(dǎo)原則[2]鼓勵(lì)采用先進(jìn)的、敏感的、正交的技術(shù)和方法對(duì)候選藥和參照藥開展全面的質(zhì)量比對(duì)研究，并盡可能使用不同原理的分析手段檢測潛在的質(zhì)量差異。并且，首選采用與參照藥一致的分析方法，采用其他技術(shù)和方法的，應(yīng)評(píng)估其優(yōu)勢和局限性，確保其符合檢測目的和相似性評(píng)價(jià)需求。用于放行檢測的分析方法應(yīng)進(jìn)行全面的方法學(xué)驗(yàn)證，用于特性鑒定的分析方法則應(yīng)確保其可適用于分析目的，分析結(jié)果具有可靠性和重現(xiàn)性。
此外，F(xiàn)DA指南[5]中提及，質(zhì)量屬性的變異包含了批內(nèi)變異和批間變異，需要關(guān)注。分析方法的高變異性通常不是設(shè)置更大可接受范圍的合理化說明，而應(yīng)該對(duì)分析方法進(jìn)行優(yōu)化，或提高每批檢測時(shí)的重復(fù)次數(shù)，以降低結(jié)果的變異性。
7、案例分享
通過查閱FDA官網(wǎng)公開的信息[16]，近年來（2018至2023年）獲批的生物類似藥，其中的質(zhì)量相似性評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)分析方法及其可接受標(biāo)準(zhǔn)情況，從中也能推測FDA在質(zhì)量相似性評(píng)價(jià)中的審評(píng)態(tài)度，（表格中僅呈現(xiàn)部分公開了相關(guān)信息的藥物資料）：
*該項(xiàng)目有的質(zhì)量屬性（ADCC）同時(shí)采用了等效性檢驗(yàn)（1.5σR）和質(zhì)量范圍（X=2）
從資料來看，各項(xiàng)目均基于風(fēng)險(xiǎn)使用了分級(jí)的策略進(jìn)行質(zhì)量相似性評(píng)價(jià)。其中，使用了等效性檢驗(yàn)的項(xiàng)目中，基本均采用了FDA推薦的1.5σR作為等效界值，當(dāng)然，作為BLA申報(bào)階段，參照藥批次數(shù)量通常已經(jīng)不是很大的問題（Zirabev和Vegzelma項(xiàng)目使用了46批參照藥進(jìn)行評(píng)估），這也使等效性檢驗(yàn)?zāi)軌虮ＷC足夠的檢驗(yàn)效能。也有部分項(xiàng)目未使用等效性檢驗(yàn)方法，而是采取了質(zhì)量范圍的方法，根據(jù)質(zhì)量屬性的風(fēng)險(xiǎn)大小，設(shè)置了不同的可接受標(biāo)準(zhǔn)。而這類策略進(jìn)行合理化說明后，都能被FDA所接受。
結(jié)語
從質(zhì)量相似性評(píng)價(jià)的統(tǒng)計(jì)工具角度出發(fā)，回顧質(zhì)量相似性評(píng)價(jià)的設(shè)計(jì)，我們需要關(guān)注如下幾個(gè)方面：
參照藥批次的代表性：其批間變異性直接影響了統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的可靠性；
參照藥與候選藥的批次數(shù)量：為了滿足統(tǒng)計(jì)分析的檢驗(yàn)效能，需要一定的批次數(shù)量和比例；在藥物研發(fā)的早期階段，因?yàn)榕螖?shù)量不足，部分統(tǒng)計(jì)分析方法可能不適用；
質(zhì)量屬性的分級(jí)和可接受標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置：質(zhì)量屬性的分級(jí)，以及可接受標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的合理性需要基于對(duì)數(shù)據(jù)的理解和對(duì)相關(guān)影響的評(píng)估，統(tǒng)計(jì)分析方法本身的局限性也可能影響到可接受標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)置。
提及統(tǒng)計(jì)分析，我們總難免會(huì)有一些畏難情緒，部分公司的CMC團(tuán)隊(duì)擁有專門的統(tǒng)計(jì)團(tuán)隊(duì)，可以由專業(yè)人士進(jìn)行相關(guān)支持，但需要注意的是，在具體問題的解決中，面對(duì)的許多問題并不是統(tǒng)計(jì)學(xué)家的問題（如活性數(shù)據(jù)的分布、質(zhì)量數(shù)據(jù)的差異和差異背后的意義等），而需要業(yè)務(wù)部門專家進(jìn)行判斷。數(shù)理統(tǒng)計(jì)已由統(tǒng)計(jì)學(xué)家完成，我們的重點(diǎn)是理解并應(yīng)用這些知識(shí)和工具解決我們的問題，比如我們這里想要討論的質(zhì)量相似性（多相似是相似，多大的差異我們可以接受）。
我們可以使用計(jì)算機(jī)程序來做統(tǒng)計(jì)，但我們也需要理解我們的用途和使用方向，如何正確地使用統(tǒng)計(jì)工具來獲得正確的結(jié)果，是我們需要結(jié)合應(yīng)用實(shí)際考慮的問題。統(tǒng)計(jì)工具與我們常接觸的分析檢測方法并無不同，粗淺地說，在執(zhí)行分析檢測或者統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，我們都需要先理解分析檢測方法和統(tǒng)計(jì)工具的適用對(duì)象、操作注意點(diǎn)，才能獲得正確的結(jié)果。
統(tǒng)計(jì)分析工具在生物制藥CMC的應(yīng)用日趨廣泛，不斷更新的藥典、指南、文獻(xiàn)中多處提及了不同的統(tǒng)計(jì)分析工具在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用，工藝表征研究（等效性檢驗(yàn)、容忍區(qū)間）、工藝變更可比性研究（等效性檢驗(yàn)、容忍區(qū)間）、穩(wěn)定性研究（效期預(yù)測）、分析方法的適用性評(píng)估（等效性檢驗(yàn)、容忍區(qū)間）、分析方法變更對(duì)比評(píng)估（等效性、非劣性檢驗(yàn)）、異常值識(shí)別（Dixon法、ESD法、ROUT法等）、分析方法驗(yàn)證（方差成分分析、統(tǒng)計(jì)過程控制）等等，因此，我們應(yīng)當(dāng)熟悉了解這些統(tǒng)計(jì)工具，并結(jié)合實(shí)際工作進(jìn)行使用，使其成為我們解決實(shí)際問題的利刃。
參考文獻(xiàn)：
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15.FDA Application number:761099Orig1s000 Product Quality Reviews
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