摘 要 / Abstract
中醫(yī)藥具有悠久的歷史，中醫(yī)在防治疾病的臨床過程中積攢下來豐富的經(jīng)驗，形成了中國獨有的中醫(yī)藥理論體系。中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，在治療復(fù)雜性疾病方面具有獨特的優(yōu)勢，但是中藥由于其組成復(fù)雜，靶點多樣，如何快速評價藥效、精準(zhǔn)高效地發(fā)現(xiàn)中藥活性成分、優(yōu)化組分配伍并明確作用靶點是中藥現(xiàn)代化研究中的難點。高內(nèi)涵篩選技術(shù)作為一項高通量、多靶點、多通道以及全自動化采集熒光圖像并進行分析的技術(shù)，能夠高通量地獲取并分析細胞對感興趣藥物所產(chǎn)生的多維生物效應(yīng)，非常適用于中藥現(xiàn)代化研究中多層次多靶點地評價藥效、篩選有效成分、詮釋配伍作用、優(yōu)化組分配伍、探究藥理機制、建立中藥潛在損傷預(yù)警體系保障用藥安全以及評價中藥質(zhì)量。本文簡要介紹了高內(nèi)涵篩選技術(shù)及其目前的發(fā)展?fàn)顩r，總結(jié)了高內(nèi)涵篩選技術(shù)在中藥現(xiàn)代化研究中的應(yīng)用進展，展望了高內(nèi)涵篩選結(jié)合3D細胞培養(yǎng)、微流控芯片、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等新興技術(shù)助力中藥現(xiàn)代化研究的新方向。
Traditional Chinese medicine(TCM) boasts a long history and a distinctive theoretical system developed through the accumulated clinical experience in disease prevention and treatment. While TCM offers unique advantages in treating complex diseases, its complex composition and diverse targets pose challenges in rapidly evaluating efficacy, precisely and efficiently discovering active ingredients, optimizing component combinations, and elucidating target actions in the modernization research of TCM. High-content screening(HCS) technology, with its high-throughput, multi-target, multi-channel, and fully automated capabilities for collecting and analyzing fluorescent images, can rapidly obtain and analyze the multidimensional biological effects of cells in response to drugs of interest. It is highly suitable for evaluating the efficacy of TCM at multiple levels and targets, screening effective components, interpreting compatibility effects, optimizing component combinations,exploring pharmacological mechanisms, establishing a toxicological early warning system for TCM safety, and evaluating the quality of TCM. This article briefly introduces the concept and current development status of HCS technology, summarizes its applications and progress in the modernization research of TCM, and envisions new directions by combining HCS with emerging technologies such as 3D cell culture, microfluidic chips, and neural networks to facilitate TCM modernization researc.
關(guān) 鍵 詞 / Key words
高內(nèi)涵篩選；中藥現(xiàn)代化；中藥藥效物質(zhì)；中藥安全性評價；中藥質(zhì)量評價
high-content screening; modernization of traditional Chinese medicine; pharmacodynamic substance of Chinese medicine; safety evaluation of Chinese medicine; quality evaluation of Chinese medicine
中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，其在重大疑難疾病、慢性病以及老年性疾病等復(fù)雜性疾病的治療上具有獨特的優(yōu)勢，在抗擊新冠疫情期間做出了重要的貢獻[1]。1996年，我國開始實施中藥現(xiàn)代化研究戰(zhàn)略。“中藥現(xiàn)代化”是指將傳統(tǒng)中藥的優(yōu)勢特色與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，詮釋、集成和發(fā)揚傳統(tǒng)中藥的理論和實踐，改造和提升中藥的現(xiàn)代研究、開發(fā)、生產(chǎn)、管理和應(yīng)用，以適應(yīng)社會發(fā)展需求的過程。在該戰(zhàn)略實施的20多年中，我國在中藥現(xiàn)代化研究、中藥標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制、中藥產(chǎn)業(yè)化、新藥研發(fā)以及推動我國中藥進入國際醫(yī)藥市場方面取得了重大的進展[2]。
在中藥現(xiàn)代化研究中，化學(xué)成分是中藥/方劑發(fā)揮藥效的基礎(chǔ)。目前針對中藥的化學(xué)成分研究是中藥研究中最活躍的一個方向，取得了快速進展。但是對于很多常用的中藥，已清楚和了解的成分仍然很少。中醫(yī)臨床用藥大多是方劑。方劑由多種中藥組成，成分更為復(fù)雜，多種效應(yīng)物質(zhì)并存，通過疊加、拮抗或是協(xié)同的作用實現(xiàn)治療效果。因此，如何從復(fù)雜的中藥物質(zhì)體系中準(zhǔn)確、系統(tǒng)且快速地辨析中藥藥效物質(zhì)是中藥現(xiàn)代化進程中亟待解決的問題[3]。高內(nèi)涵篩選技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展為快速、系統(tǒng)地篩選中藥藥效物質(zhì)提供了強有力的技術(shù)支持。高內(nèi)涵篩選技術(shù)能夠高通量、多靶點、多通道以及全自動化采集熒光圖像并進行分析[4]，符合中藥及方劑多靶點的作用特點，非常適用于中藥現(xiàn)代化研究中多層次多靶點地評價藥效，篩選有效成分，詮釋配伍作用以及探究藥理機制。
1、高內(nèi)涵篩選技術(shù)的概述
1.1高內(nèi)涵篩選的概念
高內(nèi)涵篩選的概念是美國Cellomics公司于1997年首次提出，并成功開發(fā)出來首個高內(nèi)涵篩選技術(shù)平臺[5]。高內(nèi)涵篩選具體是指在細胞結(jié)構(gòu)和功能完整的前提下，檢測藥物對細胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)各個環(huán)節(jié)的影響，從而確定藥物的生物活性和潛在毒性[6]。研究者們通常使用熒光探針或熒光蛋白對細胞的結(jié)構(gòu)、細胞因子、功能蛋白以及各種信號分子進行標(biāo)記[7]，通過自動成像的熒光顯微鏡高通量地獲取細胞的熒光圖片，再用分析技術(shù)進行多項特征的提取，最終獲取反映細胞生理狀態(tài)的多項數(shù)據(jù)[8]。
1.2高內(nèi)涵篩選平臺的組成
高內(nèi)涵篩選技術(shù)主要依賴于自動化的、高分辨率的熒光顯微成像技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)。一個高內(nèi)涵篩選平臺主要由高分辨熒光顯微鏡、自動化圖像采集系統(tǒng)、熒光標(biāo)記探針/熒光蛋白、圖像處理分析軟件和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)以及其他附加模塊組成[4]。
第一臺高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)在20世紀(jì)90年代后期由Cellomics公司生產(chǎn)，主要由全區(qū)域發(fā)光的白色光源、多道濾光片以及一臺圖像傳感照相機組成，能夠進行多色熒光圖像采集，并進行定量分析[9]。
1.3高內(nèi)涵篩選技術(shù)的優(yōu)勢
與傳統(tǒng)的高通量篩選相比，高內(nèi)涵篩選具有較為顯著的優(yōu)勢。經(jīng)典的高通量篩選方法篩選靶點單一，高內(nèi)涵篩選結(jié)果則以多指標(biāo)、多靶點共同作用作為主要特點[10]，篩選中所涉及的靶點包括細胞的膜受體、細胞器和其他胞內(nèi)成分等。高內(nèi)涵篩選和高通量篩選都是使用96/384微孔板作為載體進行篩選[11]。與高通量篩選相比，高內(nèi)涵篩選能夠獲得更多信息，所需要的檢測體積與高通量篩選一致，而且操作步驟同樣是簡單可行且自動化的。更重要的是，高內(nèi)涵篩選具有單細胞分辨率[9]，換而言之，高內(nèi)涵篩選獲取的信息是以細胞為單位的，而高通量篩選一般是采集一個孔的生化測定平均信號或者總信號，無法獲取單個細胞的信號。單個細胞的信號相比于整個孔中細胞的總生化信號或者平均生化信號，能更高程度地模擬實際生理病理情況。這是因為細胞間異質(zhì)性較高，如果測定的是整個孔中的所有細胞的平均信號，則會掩蓋單個細胞的差異。比如，在檢測細胞的病毒感染時，采用一個孔的細胞讀數(shù)，會掩蓋siRNA干擾引起的細胞表型的變化[12]。研究者在高內(nèi)涵篩選中可以從單個細胞獲取信息，從而克服細胞間的異質(zhì)性這一問題。
2、高內(nèi)涵篩選技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀
顯微鏡技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)的更新迭代推動了高內(nèi)涵篩選技術(shù)的發(fā)生發(fā)展（圖1），隨著更高分辨率、更快成像速度的高內(nèi)涵成像平臺的開發(fā)和標(biāo)記范圍越來越廣泛的熒光標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，高內(nèi)涵篩選技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。
2.1顯微鏡技術(shù)
圖像采集是高內(nèi)涵篩選的關(guān)鍵步驟，圖像的質(zhì)量決定了整個篩選的質(zhì)量。在這一步中圖像分辨率和放大率最為關(guān)鍵，足夠高的分辨率和放大倍數(shù)才能滿足捕捉表型細節(jié)的需求。在圖像采集中，必須注意避免成像偽影。照明不均勻或者光源衰減是造成成像偽影的關(guān)鍵原因。隨著工程學(xué)和計算機科學(xué)的進步，越來越多具備穩(wěn)定光源、高分辨率和快速自動聚焦的自動成像顯微鏡被開發(fā)出來，擴大了視覺表型的自動篩選范圍[11]。目前實驗室常見的高內(nèi)涵成像儀器如表1所示。
2.2熒光標(biāo)記技術(shù)
為了觀察細胞的表型，大多數(shù)高通量篩選使用熒光標(biāo)記技術(shù)對需要觀察的細胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)以及信號分子等進行標(biāo)記。熒光標(biāo)記方法主要有基因編碼的熒光蛋白、免疫熒光染色和各種化學(xué)探針[13]。1987年，Martin Chalfie和Douglas Prasher合作克隆了綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）。1994年，Science發(fā)布了大腸埃希菌表達GFP的熒光照片，此后基因編碼的熒光蛋白技術(shù)使得熒光標(biāo)記目的蛋白成為可能[14-15]。與熒光蛋白不同，化學(xué)染料的使用更為方便，標(biāo)記范圍不僅限于蛋白，還可以標(biāo)記細胞內(nèi)的信號分子。本課題組針對氧化應(yīng)激通路源頭分子超氧陰離子[16]、蛋白翻譯后修飾關(guān)鍵酶SIRT1[17]、HDAC1[18]、ACE2[19]、DDP4[20-21]等靶點開發(fā)了高特異性的新型熒光探針，并將其應(yīng)用于高內(nèi)涵篩選中。比如，應(yīng)用四嗪作為超氧反應(yīng)基團，連接上不同熒光性質(zhì)的發(fā)色團，開發(fā)了一系列高時空特異性超氧探針，使用其中綠色的熒光探針標(biāo)記了氧化應(yīng)激損傷后的H9c2細胞，結(jié)合高內(nèi)涵篩選平臺，成功篩選了223個小分子化合物，從其中發(fā)現(xiàn)了4個超氧抑制劑[16]。得益于研究者們在熒光標(biāo)記技術(shù)方面的努力，越來越多的化學(xué)染料[22]、基因編碼的熒光蛋白被開發(fā)出來，可被熒光標(biāo)記的亞細胞結(jié)構(gòu)、細胞因子、功能蛋白和信號分子范圍越來越廣，高內(nèi)涵篩選的可視化細胞表型大大增加。
2.3高內(nèi)涵分析方法
在高內(nèi)涵篩選中，為了確認命中的化合物，需要對所得圖像進行量化，以評估藥物誘導(dǎo)的變化。經(jīng)典的高內(nèi)涵圖像分析流程大致如下：首先，處理圖像以減少噪聲并校正不均勻照明，這可以使用各種濾波器來完成[23]。其次，將要分析的對象，比如單個細胞或者亞細胞器分割出來。在圖像上劃定目標(biāo)分析區(qū)域，即定義它們的輪廓，將它們表征為單獨的對象，可以使用閾值法，比如Otsu算法，先得到背景與對象區(qū)分開的二值化圖像，然后使用分水嶺算法分割相鄰的對象[24]。最后，從分割得到的對象中計算出許多數(shù)字描述符，這些數(shù)字描述符是用于編碼各種有用的特征來區(qū)分細胞表型，比如細胞器的面積或者周長，特定區(qū)域的平均強度、測量強度均勻性或異質(zhì)性、平滑度或者粗糙度等[25]。目前，有許多開源軟件集成了多種圖像處理方法，比如Fiji[26]或者CellCognition[27]等，使用方法簡單易學(xué)，使用簡單的宏代碼也可以實現(xiàn)批量處理圖像，極大地便利了高內(nèi)涵篩選的圖像處理。除了開源軟件之外，還有像CellProfiler[28]這樣的專用軟件，可以自動從細胞繪畫圖像中提取大約1500個形態(tài)特征。盡管這些軟件可以提取出許多細胞特征，但是多數(shù)參數(shù)是無意義的，這會引入噪聲并對下游分析產(chǎn)生不利影響。因此，真正的預(yù)測特征需要人為甄別，手動選擇。往往高內(nèi)涵篩選所得到的特征是海量的，需要研究者們使用數(shù)據(jù)降維方法進行特征提取，比如主成分分析法或者高斯隨機投影法等[25,29]。在此之后，對選擇或提取的特征進行統(tǒng)計分析。隨著計算科學(xué)的發(fā)展，深度學(xué)習(xí)、機器學(xué)習(xí)等方法在圖像預(yù)處理、分割對象、提取特征和選擇特征等方面成為助力高內(nèi)涵分析的有力工具[30]。本課題組基于深度學(xué)習(xí)的方法構(gòu)建了一種自適應(yīng)的細胞分割算法，利用風(fēng)格感知的預(yù)訓(xùn)練模型，結(jié)合對比微調(diào)策略，在細胞器、細胞和生物體3個層次的顯微鏡圖像數(shù)據(jù)集上實現(xiàn)了最先進的平均精度和聚合Jaccard指數(shù)可轉(zhuǎn)移性。微調(diào)該算法，其性能在大約8張圖像后趨于平穩(wěn)，僅需很少的手動操作即可獲得適合用戶使用的專業(yè)細胞分割模型[31]。此外，藥物或者遺傳擾動以及隨后出現(xiàn)的細胞形態(tài)反應(yīng)之間的關(guān)系通常是復(fù)雜的，不一定由任何單個特征捕獲。因此，與其逐個考慮這些特征，不如通過使用這些特征的適當(dāng)加權(quán)線性組合或者更復(fù)雜非線性函數(shù)來實現(xiàn)對相關(guān)表型的更敏感的區(qū)分。如2013年P(guān)NAS報道了一項研究[32]，研究者將細菌接種在384孔板上，用大約20種不同的抗生素處理，并對DNA和膜進行染色。從圖像中提取100多個特征，在這些特征上訓(xùn)練隨機森林算法，并再次發(fā)現(xiàn)能夠基于6種參考抗生素區(qū)分的具有不同作用機制的抗生素。除了研究藥物的機制，篩選對某種疾病具有治療效果的藥物也是高內(nèi)涵篩選的主要應(yīng)用方向，如何對產(chǎn)生的熒光圖像數(shù)據(jù)集進行高效的分類和解析也一直是研究者們的興趣所在。比如，DNA損傷是許多復(fù)雜疾病的罪魁禍?zhǔn)字?，人們對發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)DNA損傷的新型先導(dǎo)化合物充滿了興趣。然而，通過計算核內(nèi)病灶的數(shù)量來評估DNA損傷仍然存在很多挑戰(zhàn)。本課題組開發(fā)了一個基于深度學(xué)習(xí)的開源算法FociNet，用于自動分割全場熒光圖像并分析每個細胞的DNA損傷。FociNet能夠?qū)Ω鞣N成像平臺拍攝所得的熒光圖像進行分析，高效分類損傷細胞和正常細胞。該算法被成功地應(yīng)用于分析315種中藥天然化合物的高內(nèi)涵篩選所得的5000多個病灶圖像數(shù)據(jù)集。首次鑒定發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿、異甘草素和草質(zhì)素可以減少輻照誘導(dǎo)的foci[33]。
2.4用于高內(nèi)涵篩選的模型
目前，大多數(shù)的高內(nèi)涵篩選使用二維（2D）培養(yǎng)的細胞。2D細胞一直是了解疾病和藥物功能機制的有力工具。在細胞培養(yǎng)過程中，細胞生長為附著在培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿表面的單層[34]。這種培養(yǎng)方法有許多缺點。比如，細胞和細胞外環(huán)境缺乏相互作用，結(jié)構(gòu)與在體組織相比顯示出改變的形態(tài)，以及上皮細胞極性的喪失。此外，2D培養(yǎng)的細胞可以無限制地獲得培養(yǎng)基成分，如營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物和信號分子，這與生理條件不相似，可能導(dǎo)致非自然的基因反應(yīng)和細胞生物化學(xué)反應(yīng)[35]，從而無法模擬組織中存在的細胞功能和信號通路。因此，與在體組織相比，2D培養(yǎng)的細胞也可能無法模擬在體組織對藥物的反應(yīng)[36]。近年來，許多研究者致力于開發(fā)與在體組織生理相關(guān)程度更高的模型，從而提高篩選結(jié)果轉(zhuǎn)化臨床應(yīng)用的可行性。比如，與2D培養(yǎng)的細胞不同，三維（3D）細胞培養(yǎng)提供了細胞可以在3個維度上相互作用的環(huán)境，可以進一步模擬在體組織[37]。類器官是3D細胞培養(yǎng)的一種。早在2009年，Hans Clevers實驗室就首次將單個腸道干細胞接種在基質(zhì)膠中，使其增殖并獲得了復(fù)雜的3D組織結(jié)構(gòu)，這些復(fù)雜的3D細胞結(jié)構(gòu)包括干細胞和各種分化的細胞構(gòu)型被稱為是第一個“現(xiàn)代”類器官[38]。目前，已有成熟的實驗方案可以獲取類器官，主要有兩種途徑：一種途徑是用胚胎干細胞或者多能干細胞的固有自組織能力形成類似體內(nèi)組織的3D結(jié)構(gòu)；另一種途徑則是使用器官特異性成體干細胞[37]，它們能自我更新并產(chǎn)生祖細胞，祖細胞增殖并分化成為存在于其來源組織中的所有細胞類型[39]。鑒于類器官復(fù)雜性及其成熟的培養(yǎng)技術(shù)，人們期望類器官可以減少或者取代藥物篩選中的動物模型。Vlachogiannis等[40]培養(yǎng)了一種轉(zhuǎn)移性胃腸道癌癥患者的衍生類器官模型，用它們來預(yù)測患者的治療反應(yīng)，并使用了一個化合物庫測試了類器官對患者反應(yīng)的敏感性。研究結(jié)果表明，陽性預(yù)測值為88%。由此說明，類器官可以用于高通量藥物篩選，并且能夠更高程度地模擬在體組織的情況。利用3D細胞培養(yǎng)技術(shù)，構(gòu)建更貼近在體組織的仿生模型，有望加速高內(nèi)涵篩選實驗結(jié)果到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。除了使用3D培養(yǎng)的細胞或者類器官，本課題組還利用斑馬魚和線蟲這樣的模式生物構(gòu)建了模擬多種疾病的高內(nèi)涵篩選模型。圖2對本課題組已有的高內(nèi)涵篩選模型及藥效評價模型進行了總結(jié)。比如，首先使用阿霉素構(gòu)建斑馬魚心衰模型，結(jié)合深度學(xué)習(xí)實現(xiàn)了使用斑馬魚胚胎高內(nèi)涵篩選了300余個中藥化合物，并首次發(fā)現(xiàn)了氯化矢車菊素、迷迭香酸、2''-O-?；鸾z桃苷等10余個具有抗心衰活性的中藥成分，并對氯化矢車菊素的藥效在整體動物模型上進行了評價，深入研究了其抗心衰的作用機制[41]。此外，本課題組還在過表達皮膠原XII(COL-12）的秀麗隱桿線蟲上使用GFP標(biāo)記了COL-12，之后利用高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)和圖像分割算法Scel seg構(gòu)建了基于線蟲的高內(nèi)涵篩選模型。探索可能在膠原生物發(fā)生、分泌和組裝中發(fā)揮重要作用的天然小分子化合物，對614個天然小分子化合物進行了篩選，經(jīng)過驗證篩選所得的丹參素、指甲花醌和血根堿對COL-12的合成或分泌更有效[42]。
3、高內(nèi)涵篩選技術(shù)在中藥現(xiàn)代化研究中的應(yīng)用進展
近年來，在中藥領(lǐng)域使用高內(nèi)涵篩選技術(shù)的研究逐年攀升。在中藥現(xiàn)代化研究中的高內(nèi)涵篩選可以大致分為兩種：基于靶點的篩選和表型篩選。對于基于靶點的篩選，首先要明確靶點，再用熒光標(biāo)記的方法，比如基因編碼的熒光蛋白或者是化學(xué)染料，使感興趣的靶點可視化。而表型篩選則是基于細胞整體的表型變化來篩選藥物，不需要靶點先驗知識，可檢測的表型包括細胞或細胞器形態(tài)、細胞代謝情況、細胞黏附遷移情況、細胞周期調(diào)節(jié)和凋亡情況以及第二信使等。明確了使用哪種篩選之后，研究者一般會先構(gòu)建相關(guān)的細胞模型，使用熒光標(biāo)記技術(shù)對靶點和表型進行可視化，這里需要研究者在大規(guī)模篩選應(yīng)用之前，首先測試模型是否構(gòu)建成功以及熒光標(biāo)記是否成功，以確認適用性并確保特定和可測的關(guān)鍵靶標(biāo)或表型。在此之后，再進行大規(guī)模篩選，用于篩選的對象可以是方劑、藥材提取物、組分以及中藥單體化合物，將藥物與細胞共孵育后，進行熒光標(biāo)記（由基因編碼的熒光蛋白則略過這一步），使用高內(nèi)涵成像平臺獲取高通量的細胞圖像，對圖片進行分析處理或特征提取，數(shù)據(jù)分析后，獲得有效的化合物，最后對所獲得的化合物進行二次篩選或者使用其他手段驗證其藥效。目前，研究者們大多利用2D培養(yǎng)的細胞進行高內(nèi)涵篩選以研究中藥藥效物質(zhì)、評價藥物安全性和中藥質(zhì)量以及提升中藥標(biāo)準(zhǔn)化和產(chǎn)業(yè)化。
3.1應(yīng)用高內(nèi)涵篩選技術(shù)研究中藥藥效物質(zhì)
高內(nèi)涵篩選技術(shù)在中藥藥效評價和中藥藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的研究中廣受研究者的青睞。研究者們常使用表型篩選的方式，構(gòu)建對應(yīng)疾病的體外模型，對其中的關(guān)鍵表型進行熒光標(biāo)記，再使用高內(nèi)涵篩選技術(shù)評價藥效以及篩選有效成分。
方劑是中醫(yī)臨床遣方用藥的主要形式[3]，體系復(fù)雜、化學(xué)成分繁多，因此高內(nèi)涵篩選在中藥復(fù)方研究中優(yōu)點最為突出。本課題組將高內(nèi)涵篩選技術(shù)與高分辨質(zhì)譜、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合起來，構(gòu)建了斑馬魚炎性腸病高內(nèi)涵篩選模型，從桃花湯、白頭翁湯、葛根芩連湯3個與炎性腸病相關(guān)的仲景方中制備了74個組分，以活性氧水平為篩選標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)了6種有效成分對腸道的炎癥表型具有較強的抑制作用[43]。在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大模型上明確了通脈養(yǎng)心丸對心肌肥大的抑制作用，并從該復(fù)方中鑒定出了4種抗心肌肥大的有效成分[44]。同樣是對通脈養(yǎng)心丸的研究，Liu等[45]構(gòu)建了腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）體外模型，使用高內(nèi)涵篩選技術(shù)自動采集和處理雙熒光標(biāo)記的圖像識別EMT抑制劑，結(jié)合色譜分離和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了其中5個組分具有抗EMT活性，從中進一步鑒定了甘草酸、粗毛甘草素A和甘草酸內(nèi)酯A對EMT有抑制作用。此外，一些方劑在臨床應(yīng)用中具有顯著的療效，但是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，使其廣泛應(yīng)用被限制，高內(nèi)涵篩選技術(shù)在鑒定這類方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)方面優(yōu)勢突出。比如，宣肺敗毒方在臨床治療新冠病毒感染中療效顯著，但藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制不明確，本課題組在高分辨質(zhì)譜、液質(zhì)聯(lián)用對復(fù)方成分分離鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合質(zhì)譜分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)和高內(nèi)涵篩選，在巨噬細胞系和斑馬魚損傷模型中鑒定了宣肺敗毒方中來自不同藥材的多種活性成分的生物學(xué)效應(yīng)，比如虎杖、蘆根和化橘紅中的虎杖苷、異甘草素和洋丁香酚苷可以強烈下調(diào)巨噬細胞的活化。茅蒼術(shù)、青蒿草和麻黃中的活性成分白術(shù)內(nèi)酯I、山柰酚和麻黃堿被發(fā)現(xiàn)能顯著抑制內(nèi)源性巨噬細胞的遷移[46]。
高內(nèi)涵篩選技術(shù)在單味中藥和中藥化合物的藥效物質(zhì)中應(yīng)用也頗為廣泛。趙志敏等[47]利用高內(nèi)涵篩選技術(shù)觀察黃芪來源的成分對肝竇內(nèi)皮細胞缺氧損傷的保護作用，實驗結(jié)果表明，黃芪來源的7種單體成分對缺氧損傷的肝竇內(nèi)皮細胞有明顯保護作用。在中藥化合物藥效研究中，Wang等[48]使用轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1）誘導(dǎo)正常大鼠的腎成纖維細胞NRK-49F纖維化，建立了穩(wěn)定的腎纖維化體外模型，以肌成纖維細胞標(biāo)志α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）作為檢測指標(biāo)，篩選了包含344個中藥分子的標(biāo)準(zhǔn)中藥化合物庫，共鑒定出16種化合物具有潛在的抑制活性。Wang等[49]利用高內(nèi)涵篩選技術(shù)成功在中藥化合物庫中篩選出丹酚酸A、丹酚酸B和鞣花酸對泛素-蛋白酶體系統(tǒng)有激活作用。上述研究均基于固定的時間點對細胞進行圖像采集分析，而高內(nèi)涵成像不僅可以對固定時間點的細胞進行采集，還可以對細胞效應(yīng)進行動態(tài)追蹤。倪曉晨等[50]使用高內(nèi)涵成像追蹤細胞軌跡并對細胞運動功能進行測定，在傷口愈合模型上鑒定了南蛇藤提取物能夠劑量依賴性地抑制非小細胞肺癌細胞的遷徙能力。
目前，使用高內(nèi)涵篩選技術(shù)研究方劑、中藥以及中藥化合物的有很多，但是對于組分配伍和優(yōu)化的研究較少。組分配伍是中醫(yī)遣方用藥的核心，對組分配伍的研究可能是闡釋其中科學(xué)內(nèi)涵的一種解題思路[3]。畢蕾等[51]利用高內(nèi)涵篩選平臺分析丹參-人參組分配伍對肺癌A549細胞遷移的作用，結(jié)果表明，丹參-人參組分配伍可以顯著降低細胞遷移的面積，對A549細胞遷移有抑制作用，且呈劑量依賴性。充分表明了中藥組分配伍可以起到增效的作用，而高內(nèi)涵篩選技術(shù)的高通量、多通道特點，為研究中藥組分配伍研究提供了強有力的平臺。本課題組在國內(nèi)率先使用高內(nèi)涵篩選進行中藥藥效物質(zhì)的研究，并在組分配伍研究方面做了一些探索。綜合運用前文提到的針對氧化應(yīng)激通路源頭分子超氧陰離子、蛋白翻譯后修飾關(guān)鍵酶SIRT1、HDAC1、ACE2、DDP4等靶點開發(fā)的高特異性的新型熒光探針，采用“亞細胞器—細胞—3D細胞球/類器官—整體動物模型”多層次高內(nèi)涵藥效評價方法和基于深度學(xué)習(xí)的高內(nèi)涵圖像分析方法[32-33]，構(gòu)建了具有多靶點標(biāo)記技術(shù)、多層次藥理學(xué)模型以及人工智能（AI）賦能高效分析方法的高內(nèi)涵篩選平臺用于中藥藥效物質(zhì)研究，并結(jié)合中醫(yī)藥典籍等文獻資料，整合方劑化學(xué)分析數(shù)據(jù)和多組學(xué)數(shù)據(jù)等，運用知識發(fā)現(xiàn)和關(guān)聯(lián)分析等手段，挖掘出方-證-病間相互關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)了ACE2、SGK1、SIRT1等中成藥治療心血管疾病的潛在作用靶點群，明確了主要作用途徑以合理選擇評價模型，從而發(fā)現(xiàn)了一批中藥藥效物質(zhì)，對通脈養(yǎng)心方[34]、宣肺敗毒方[36]和冠心寧片[52]的藥效辨析、組分配伍和作用機制的研究充分證明了高內(nèi)涵篩選技術(shù)在明晰中藥復(fù)方配伍規(guī)律、作用機制和有效成分群辨識方面的潛力，研究流程概括總結(jié)如圖3所示。
3.2應(yīng)用高內(nèi)涵篩選技術(shù)評價中藥安全性
中藥臨床應(yīng)用的安全性缺乏科學(xué)、客觀的評價方法和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，一直是中醫(yī)藥研究者和百姓關(guān)注的問題，建立中藥安全性預(yù)警體系是中藥現(xiàn)代化發(fā)展中需要直面的問題。高內(nèi)涵篩選技術(shù)與傳統(tǒng)分析技術(shù)相比，能夠通過較少的實驗全面地獲得因藥物造成的細胞形態(tài)和標(biāo)志分子的微小變化，更加準(zhǔn)確地分析出藥物的潛在安全隱患[53]。
郭曉等[54]使用HEK293細胞系作為模型，選擇具有明顯腎損傷的化合物馬兜鈴酸A和環(huán)孢素A作為陽性對照，建立了一種基于細胞表型的高內(nèi)涵多指標(biāo)中藥腎損傷檢測方法，檢測指標(biāo)為細胞存活率、細胞核面積、細胞核圓度、線粒體質(zhì)量和線粒體膜電位。對文獻中報道的18種具有潛在腎損傷的中藥化合物進行篩選。實驗結(jié)果表明，該方法可應(yīng)用于建立中藥腎損傷安全預(yù)警體系。方劑中具有潛在腎損傷成分的發(fā)現(xiàn)也非常重要。楊春啟等[55]通過高內(nèi)涵成像系統(tǒng)結(jié)合腎小管上皮細胞HK-2模型篩選了左金丸中主要生物堿類組分對腎細胞的損傷，通過高內(nèi)涵成像系統(tǒng)對細胞數(shù)目、細胞膜通透性和線粒體膜電位的分析，發(fā)現(xiàn)了該復(fù)方中吳茱萸堿能夠顯著降低細胞數(shù)目導(dǎo)致細胞損傷，是導(dǎo)致腎損傷的主要成分，為安全使用該方劑提供了客觀科學(xué)的指導(dǎo)。此外，高內(nèi)涵分析技術(shù)還可以應(yīng)用于腎損傷機制的研究中。路青瑜等[56]使用高內(nèi)涵篩選技術(shù)分析了山柰酚對細胞數(shù)目、活性氧水平、線粒體膜電位和Ca2+內(nèi)流水平的影響，鑒定了山柰酚對人腎近曲小管HK-2的毒性之后，使用免疫熒光的方法對氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白標(biāo)記后，在高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)上進行分析，進一步發(fā)現(xiàn)其損傷機制與促進活性氧水平升高而導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡相關(guān)。
此外，藥物潛在的肝損傷在藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用方面一直備受關(guān)注，因為肝臟承擔(dān)著藥物代謝轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵作用。目前已明確具有潛在肝損傷風(fēng)險的中藥包括生物堿類（如千里光屬、澤蘭屬、款冬屬等）、苷類（如黃藥子、何首烏等）、毒蛋白類（如蓖麻子、相思豆等）、多肽類（如毒蕈傘含有的毒傘肽和毒肽等）、萜與內(nèi)酯類（如川楝子、艾葉等）、鞣質(zhì)類（如五倍子、石榴皮等）、動物類（如蜈蚣、蟾酥等）、礦物類（如含汞、砷、鉛的礦物藥等）[57]。但是還有許多中藥在服用過程中造成肝損傷的發(fā)病機制和原因尚不明確，需要研究者們深入研究。高內(nèi)涵篩選技術(shù)因其能夠靈敏穩(wěn)定、簡單易行地獲得目的藥物對細胞產(chǎn)生的實時多維立體的生物效應(yīng)信息，為體外預(yù)警肝損傷風(fēng)險和研究其作用機制規(guī)避損傷風(fēng)險提供了強有力的工具。耿興超等[58]為了篩選何首烏中潛在的致肝損傷的風(fēng)險成分，采用4種人源肝細胞系建立CCK-8體外高通量篩選方法，對其總提物及其分部進行篩選，確定潛在風(fēng)險成分分部。對其中16種代表性單體化合物進一步篩選，確定潛在風(fēng)險成分。最后通過高內(nèi)涵分析平臺檢測潛在風(fēng)險成分對亞細胞器的影響，初步探索其機制，基本確定了沒食子酸為何首烏中潛在的致肝損傷的危險成分，確定了其通過引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致肝細胞損傷。除了這種針對某種中藥或者方劑的潛在肝損傷成分的發(fā)現(xiàn)和機制研究，余璇等[59]基于兩種肝細胞系，采用多種熒光探針分析多種細胞表型，對56種中藥活性成分進行了肝損傷快速篩選評價，篩選結(jié)果證明了高內(nèi)涵篩選方法適用于大規(guī)模初步篩選預(yù)警中藥活性成分潛在的肝損傷風(fēng)險。
多種研究實例證明，高內(nèi)涵篩選技術(shù)因其能夠快速獲得多維細胞生物學(xué)效應(yīng)，從而能快速簡便地評價和篩選從中藥化合物到復(fù)雜方劑潛在的風(fēng)險成分，并發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵致機體損傷成分，但是目前研究多集中于中藥潛在的肝腎損傷研究中，對其他潛在的風(fēng)險研究較少，且多集中于中藥活性化合物的應(yīng)用，缺乏對方劑和組分的評價。
3.3應(yīng)用高內(nèi)涵篩選技術(shù)建立中藥質(zhì)量評價體系
中藥質(zhì)量評價是中藥現(xiàn)代化進程的關(guān)鍵問題之一，中藥材、中藥飲片以及中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量是保證中藥臨床有效性、安全性的基礎(chǔ)，同時也是促進中藥國際化、產(chǎn)業(yè)化和現(xiàn)代的關(guān)鍵[2]。中藥的質(zhì)量是中藥化學(xué)物質(zhì)綜合生物效應(yīng)的整體表現(xiàn)，其特點是多成分、多功效和整體性?，F(xiàn)代中藥質(zhì)量評價體系以“找成分，測含量”為主，以高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用、紫外光譜等技術(shù)為主的化學(xué)評價能夠宏觀地反映中藥的物質(zhì)成分，而基于生物體系和藥效實驗的生物評價則更能夠總體評價和表征中藥的安全性和有效性[60]。高內(nèi)涵篩選技術(shù)與傳統(tǒng)的分析實驗相比，高內(nèi)涵成像平臺多通道地采集藥物對細胞的生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)中藥的生物質(zhì)量標(biāo)志物，從而構(gòu)建分析方法，方法構(gòu)建完畢后，能夠通過較少的樣本和較少的實驗以及較少的時間高通量地快速評價多批次、多產(chǎn)地的中藥質(zhì)量。比如，阿膠作為臨床常用的名貴中藥，長期以來因產(chǎn)品質(zhì)量問題備受關(guān)注，究其原因是與其臨床功效相關(guān)的質(zhì)量評價方法的缺失。劉靖等[61]采用高內(nèi)涵篩選技術(shù)，建立了基于小鼠巨噬細胞系RAW 264.7吞噬模型的阿膠生物活性評價方法，實現(xiàn)了對不同品質(zhì)的阿膠的質(zhì)量評價。在相同的細胞模型上，曹俊嶺等[62]結(jié)合高內(nèi)涵分析，比較了鐵棍山藥和非鐵棍山藥促進巨噬細胞吞噬活性的差異，分析了11個批次山藥的藥效，鐵棍山藥的生物效價明顯高于非鐵棍山藥，為山藥的質(zhì)量評價構(gòu)建了快速簡便的方法。
3.4應(yīng)用高內(nèi)涵篩選技術(shù)助力中藥標(biāo)準(zhǔn)化和中藥新藥藥品注冊
中藥標(biāo)準(zhǔn)化是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容之一[2]，包括中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)代化和國際化、中藥質(zhì)控技術(shù)的現(xiàn)代化、中藥安全性評價研究。如前文提到的，已有研究將高內(nèi)涵篩選技術(shù)應(yīng)用于評價中藥的毒性，構(gòu)建中藥毒性預(yù)警體系[45-49]。另外利用中藥的生物學(xué)效應(yīng)，應(yīng)用高內(nèi)涵分析技術(shù)構(gòu)建快速簡便的質(zhì)量評價體系[51-52]。證明了高內(nèi)涵篩選技術(shù)在中藥標(biāo)準(zhǔn)化方面有著巨大的應(yīng)用前景。高內(nèi)涵篩選技術(shù)所獲得的中藥材、中藥復(fù)方以及中藥制劑的多維、海量的生物學(xué)效應(yīng)信息對進一步提高中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)代化和國際化大有裨益，同時也可以作為現(xiàn)代化中藥質(zhì)控技術(shù)的一種。此外，該技術(shù)還能實現(xiàn)快速評價中藥安全性，全面助力提升中藥標(biāo)準(zhǔn)。
中藥新藥研發(fā)的主要來源是中醫(yī)藥長期的臨床實踐與經(jīng)驗總結(jié)，現(xiàn)有的中藥復(fù)方新藥研究多是基于已有臨床實踐經(jīng)驗和確切療效的中藥方劑基礎(chǔ)上的研究，來源主要包括經(jīng)典名方、臨床經(jīng)驗方、民間藥方等[63]。2015～2020年，中藥新藥獲批的數(shù)量為個位數(shù)，尤其從2016年開始，每年僅有1～4個品種獲批[64]。2019年發(fā)布的《中共中央國務(wù)院關(guān)于促進中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的意見》中提出：改革完善中藥注冊管理，及時完善中藥注冊分類，加快構(gòu)建中醫(yī)藥理論、人用經(jīng)驗和臨床試驗相結(jié)合的中藥注冊審評證據(jù)體系。支持中藥新藥以臨床應(yīng)用價值為導(dǎo)向，注重藥品的安全性、有效性和質(zhì)量可控性[64]。因此，對于中藥新藥研發(fā)要加強物質(zhì)基礎(chǔ)、藥效特點、安全性研究和評價、借鑒現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的循證醫(yī)學(xué)理念創(chuàng)新中藥臨床療效評價體系、充分采用適宜的制劑技術(shù)，確保發(fā)揮療效優(yōu)勢和降低安全風(fēng)險[2]。高內(nèi)涵篩選技術(shù)在明晰中藥作用機制、辨識有效成分群、定量設(shè)計和優(yōu)化有效成分群組方和質(zhì)控方面具有明顯的優(yōu)勢。比如，在作用機制和有效成分辨識方面，本課題組在紅景天、通脈養(yǎng)心方[34]、宣肺敗毒方[36]和冠心寧片[52]的藥效辨析和作用機制的研究，充分證明了高內(nèi)涵篩選技術(shù)在明晰中藥或中藥復(fù)方作用機制和有效成分群辨識方面的潛力。中藥復(fù)方需要從多組分、多劑量、多配比中優(yōu)選[2]，而高內(nèi)涵篩選技術(shù)能夠同時獲取高通量、多維度信息的特點則恰好符合實現(xiàn)自動化優(yōu)化多變量、多指標(biāo)的需求。因此，高內(nèi)涵篩選技術(shù)能夠為中藥新藥注冊和獲批提供更多的研究信息和科學(xué)支撐，助力中藥新藥注冊。
4、展望
面對中藥現(xiàn)代化的發(fā)展需求，高內(nèi)涵篩選技術(shù)為中藥藥效物質(zhì)研究、中藥安全性評價以及中藥質(zhì)量評價提供了有力的幫助。如上所述，廣大中藥研究者也借助高內(nèi)涵成像平臺解決了中藥現(xiàn)代化中的一些問題，研究者能夠利用高內(nèi)涵成像多通道、多靶點的特點較為全面地發(fā)現(xiàn)中藥藥效物質(zhì)及作用靶點，系統(tǒng)地揭示其中一些方劑的科學(xué)內(nèi)涵，但尚有許多問題未能解決，比如目前中藥研究中高內(nèi)涵篩選的通量較低，對于組分配伍和組分優(yōu)化的研究甚少。隨著熒光標(biāo)記技術(shù)的進步，越來越多的靶點、信號分子和蛋白質(zhì)能夠可視化，3D仿生模型構(gòu)建技術(shù)、微流控技術(shù)的發(fā)展則使可用于高內(nèi)涵篩選的體外模型越來越貼近真實的在體組織、光學(xué)顯微鏡的迭代更新會使高內(nèi)涵成像系統(tǒng)的分辨率越來越高，能夠捕捉更微小的生物學(xué)效應(yīng)，圖像分割、特征提取以及機器學(xué)習(xí)的算法的推陳出新也使得高內(nèi)涵分析能力越來越強。未來可能借助更加強大的高內(nèi)涵篩選云平臺，實現(xiàn)自動化（無人值守復(fù)合機器人系統(tǒng)避免實驗誤差）、數(shù)字化（全生命周期管理實現(xiàn)實驗流程追溯和實驗數(shù)據(jù)分析平臺支撐多維度篩選）和智能化（智能化引擎精準(zhǔn)調(diào)度實驗操作和智能化設(shè)備支持多種研發(fā)實驗流程）的中藥現(xiàn)代化研究，比如中藥功效組分智能辨識與組方優(yōu)化等。
京公網(wǎng)安備11010802046783號
