剛剛，中檢院發(fā)布《化妝品防腐劑挑戰(zhàn)試驗技術(shù)指南（征求意見稿）》，內(nèi)容如下：
化妝品防腐劑挑戰(zhàn)試驗技術(shù)指南（征求意見稿）
1.范圍
本標準規(guī)定了化妝品防腐效能的評價方法。
本標準適用于含水的（AW≥0.7）乳液類和膏霜類等常見化妝品防腐體系效能評價。
2.術(shù)語和定義
2.1 防腐效能評價試驗
將一定量的微生物人工污染到化妝品中，模擬化妝品可能出現(xiàn)的污染情況，每隔一定時間檢測其中的存活菌量，根據(jù)存活菌量的變化評價化妝品防腐體系效能的試驗方法。
2.2 中和劑
可添加至化妝品和微生物混和物中，消除化妝品對微生物抑制或殺滅作用的試劑。
2.3 淋洗類化妝品
在人體表面（皮膚、毛發(fā)、甲、口唇等）使用后及時清洗的化妝品。
2.4 駐留類化妝品
除淋洗類產(chǎn)品外的化妝品。
3.設(shè)備和材料
3.1 生物安全柜。
3.2 高壓蒸汽滅菌器。
3.3 天平：感量為0.1g。
3.4 恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃、28℃±2℃。
3.5 均質(zhì)器。
3.6 無菌吸管：1mL(具0.01mL 刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
3.7 顯微鏡。
3.8 酸度計。
3.9滅菌平皿：直徑90mm。
4.培養(yǎng)基和試劑
4.1 0.85%生理鹽水。
4.2 含0.05%(v/v)聚山梨酯80的生理鹽水，見附錄A.1。
4.3 含0.05%(v/v)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，見附錄A.2。
4.4 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），見附錄A.3。
4.5 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA) ，見附錄A.4。
4.6 SCDLP液體培養(yǎng)基，見附錄A.5。
4.7 改良Eugon LT 100 肉湯，見附錄A.6。
4.8 D/E肉湯，見附錄A.7。
4.9 改良Letheen肉湯，見附錄A.8。
5.實驗菌株
5.1細菌：
金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003
大腸埃希氏菌CMCC（B）44102
銅綠假單胞菌CMCC（B）10104
表皮葡萄球菌 CMCC（B）26629
5.2真菌：
黑曲霉CMCC（F）98003
白色念珠菌CMCC（F）98001
在進行化妝品防腐效能評價試驗時，可根據(jù)需要增加其他相關(guān)細菌或真菌作為測試菌株。如不采用本指南推薦的菌株，需說明菌株與指南中載明的菌株開展過驗證，并且結(jié)果一致。
6.實驗方法
6.1 供試品微生物檢測
取不少于2份包裝完好的供試化妝品樣品，依據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》第五章微生物檢驗方法中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌檢驗方法對樣品進行檢測。供試品微生物檢測的結(jié)果可記為Nf。
6.2 微生物懸液制備
6.2.1 細菌懸液制備
用接種環(huán)從菌種保存管中（或試管斜面上）取適量菌體，分區(qū)劃線接種于TSA平板上，36℃±1℃，培養(yǎng)18 h?24 h。用接種環(huán)取第1 代培養(yǎng)物，分區(qū)劃線接種于TSA平板，36℃±1℃，培養(yǎng)18 h?24 h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，分區(qū)劃線接種于TSA平板，36℃±1℃，培養(yǎng)18 h?24 h，即為第3 代培養(yǎng)物。用無菌棉簽取菌苔加入無菌生理鹽水中，渦旋混勻。用無菌生理鹽水將其稀釋成約1×107 CFU/mL ?1×108 CFU/mL 的菌懸液。制備好的菌懸液應(yīng)在2 h 內(nèi)使用，或在2℃?8℃保存不超過24 h。
6.2.2 白色念珠菌菌懸液的制備
用接種環(huán)從菌種保存管中（或試管斜面上）取適量菌體，分區(qū)劃線接種于SDA平板上，28℃±2℃，培養(yǎng)48 h?72 h。用接種環(huán)取第1 代培養(yǎng)物，分區(qū)劃線接種于SDA平板，28℃±2℃，培養(yǎng)48 h?72 h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，分區(qū)劃線接種于SDA 平板，28℃±2℃培養(yǎng)48 h?72 h，即為第3 代培養(yǎng)物。用無菌棉簽取菌苔加入無菌生理鹽水中，渦旋混勻。用無菌生理鹽水將其稀釋成約1×106 CFU/mL ?1×107 CFU/mL 的菌懸液。制備好的菌懸液應(yīng)在2 h 內(nèi)使用，或在2℃?8℃保存不超過24 h。
6.2.3黑曲霉孢子懸液的制備
用接種環(huán)從菌種保存管中（或試管斜面上）取適量的菌體，分區(qū)劃線接種于SDA平板上，28℃±2℃培養(yǎng) 3 d～5 d。用無菌棉簽取菌苔加入含0.05%(v/v) 聚山梨酯80無菌生理鹽水中，制備孢子懸液，輕輕振搖 1 min 后，用無菌玻璃棉過濾除去菌絲。用含 0.05%(v/v) 聚山梨酯 80 無菌生理鹽水將其稀釋成約 1×106 CFU/mL?1×107 CFU/mL 的孢子懸液。制備好的孢子懸液應(yīng)當天使用或在 2℃?8℃保存不超過7 d，使用前混合均勻，并在顯微鏡下觀察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，則棄之不用。
表1 實驗菌株培養(yǎng)條件
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培養(yǎng)基
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培養(yǎng)溫度
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培養(yǎng)時間
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金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003
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TSA
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36℃±1℃
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18 h?24 h
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大腸埃希氏菌CMCC（B）44102
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TSA
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36℃±1℃
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18 h?24 h
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銅綠假單胞菌CMCC（B）10104
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TSA
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36℃±1℃
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18 h?24 h
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表皮葡萄球菌CMCC（B）26629
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TSA
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36℃±1℃
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18 h?24 h
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黑曲霉CMCC（F）98003
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SDA
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28℃±2℃
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3 d?5 d
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白色念珠菌CMCC（F）98001
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SDA
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28℃±2℃
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48 h?72 h
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注：實驗室增加的其他測試菌株可參考以上細菌及真菌的培養(yǎng)溫度和時間進行培養(yǎng)。
6.3 中和劑效果驗證試驗
6.3.1 工作菌懸液制備
用稀釋液將上述菌懸液10倍系列稀釋至103 CFU/mL，用于中和劑效果驗證。
6.3.2驗證試驗分組
每種試驗菌株的中和劑效果驗證試驗應(yīng)分別進行。
試驗分為以下三組，按如下方法進行供試液染菌。
試驗組：將1g(mL)供試品加入9mL中和劑中混勻，室溫放置30min±15min，使其充分作用；
中和劑對照組：將1mL稀釋液加入9 mL中和劑中，室溫放置30min±15min；
菌液對照組：10 mL稀釋液。
在以上三組中，分別加入6.3.1中制備的工作菌懸液各1mL。
6.3.3 培養(yǎng)與計數(shù)
分別對試驗組、中和劑對照組和菌液對照組進行平板計數(shù)，每組接種兩個平皿。各組計數(shù)結(jié)果取平均值，試驗組計數(shù)結(jié)果記作Nvf，中和劑對照組計數(shù)結(jié)果記作Nvn，菌液對照組計數(shù)結(jié)果記作Nv，6.1中供試品微生物檢測組結(jié)果記作Nf。
6.3.4 結(jié)果判定
當Nvn / Nv 接近（如0.5 ≤ Nvn / Nv ≤ 2），并且（Nvf - Nf）/ Nvn≥ 0.5時，判定中和劑有良好的中和效果，通過中和效果驗證。
若供試樣品測試未能通過中和效果驗證，可以更換中和劑或增加中和劑用量?？蛇x用的中和劑請參考附錄A.5～A.8，或根據(jù)需求選擇適宜的中和劑進行中和效果驗證。
6.4 供試品防腐效能測試
6.4.1 供試品染菌
防腐效能測試實驗采用單一菌種染菌的測試方式，即分別用每種測試菌株的菌懸液人工污染供試化妝品，每隔一定時間檢測其中的存活菌量，根據(jù)存活菌量的變化判斷化妝品防腐體系效能。
分別取6.2中制備的菌液，加入裝有不少于20g(mL)供試化妝品原包裝中，或加入裝有20g(mL)供試化妝品的適宜容器中，充分混勻，菌液的接種體積不得超過供試化妝品體積的1%。細菌的染菌濃度為1×105 CFU/g(mL) ?1×106 CFU/g(mL)，黑曲霉和白色念珠菌的染菌濃度為1×104 CFU/g(mL) ?1×105 CFU/g(mL)。染菌后的樣品放置于25℃±1℃培養(yǎng)箱中，分別在1、7、14和28天檢測其中的存活菌量，分別計作Nx（X=1，7，14，28）。
6.4.2 計數(shù)方法
放置至規(guī)定時間后，取1g（mL）染菌樣品，加入9 mL經(jīng)6.3驗證有效的中和劑中（樣品的稀釋倍數(shù)應(yīng)與6.3中和劑中和樣品的稀釋倍數(shù)保持一致，保證樣品中的抑菌成分可以有效中和），充分混勻。室溫中和30min±15min后，吸取2 mL樣液，分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL，將45℃?50℃的相應(yīng)培養(yǎng)基15mL注入平板，混勻，凝固后按要求進行倒置培養(yǎng)、計數(shù)。如平板上預期生長菌落數(shù)較多，可進行10倍系列稀釋，選擇適宜的稀釋度進行平板計數(shù)。
計數(shù)結(jié)果報告方式可參考《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》第五章2.菌落總數(shù)檢驗方法和6.霉菌和酵母菌檢驗方法。
6.4.3 計算方法
化妝品防腐效能評價可以用供試品中存活菌量常用對數(shù)減少值（Rx）作為評價指標，計算方式見式（1）：
Rx=lgN0 - lgNx………………………………………（1）
式中：
N0——供試樣品初始染菌量的常用對數(shù)值。（即染菌菌懸液濃度的常用對數(shù)值）
Nx——不同檢測時間，供試樣品中存活菌量的常用對數(shù)值。
6.4.4 結(jié)果判定
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不同取樣時間供試品中存活菌量常用對數(shù)減少值( )a
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細菌
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白色念珠菌
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黑曲霉
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T1b
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T7
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T14
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T28
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T7
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T14
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T28
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T14
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T28
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判定標準A
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≤5c
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≥3
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≥3且NId
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≥3且NI
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≥1
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≥1且NI
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≥1且NI
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≥0 f
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≥1且NI
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判定標準B
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≤5c
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-e
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≥3
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≥3且NI
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-
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≥1
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≥1且NI
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≥0
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≥0且NI
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a. 在防腐效能測試中，可接受偏差范圍為±0.5 log。
b. T1測試時間為供試品染菌后22?24小時；
c. 僅駐留類供試品需在T1時間點測試，淋洗類供試品無需在T1時間點進行測試。T1時間點的測試菌株包括金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌和表皮葡萄球菌，任一細菌的測試結(jié)果滿足≤5即認為符合T1時間點的評價要求；T7、T14和T28時間點除表皮葡萄球菌外，需所有測試菌株均滿足表中相應(yīng)要求。
d. NI：與上一時間點的計數(shù)結(jié)果相比，差異未超過±0.5 log；
e. “–”表示無需進行測試；
f. Nx與初始染菌量N0相比，差異未超過±0.5 log時，Rx=0。
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—判定標準A，適用于不考慮其它控制因素條件下，產(chǎn)品配方能有效防止可能會對消費者構(gòu)成潛在安全風險微生物增殖的產(chǎn)品。
—判定標準B，適用于除產(chǎn)品組方因素外，對微生物污染采取了經(jīng)風險評估有效的其他控制方式的產(chǎn)品。
參考《化妝品安全評估技術(shù)導則》（2021年版）6.3.3部分，如屬于不易受微生物污染的產(chǎn)品，即非含水產(chǎn)品、有機溶劑為主的產(chǎn)品、含水產(chǎn)品中如水活度<0.7、乙醇含量>20％（體積）、高/低pH值（≥10或≤3）、一次性或包裝不能開啟類型的產(chǎn)品，可不進行防腐效能評價。
附 錄 A（規(guī)范性附錄）
培養(yǎng)基和試劑
A.1 含0.05%(v/v)聚山梨酯80的生理鹽水
成分: 氯化鈉 8.5g
聚山梨酯 80 0.5g
水 1000mL
制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌20min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.0±0.2。
A.2 含0.05%(v/v)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液
成分: 無水磷酸氫二鈉 5.8g
磷酸二氫鉀 3.6g
氯化鈉 4.3g
蛋白胨 1.0g
聚山梨酯 80 0.5g
水 1000mL
制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.0后的培養(yǎng)。
A.3 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）
成分: 胰酪胨 15.0g
大豆蛋白胨 5.0g
氯化鈉 5.0g
瓊脂 15.0g
水 1000mL
制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.3后的培養(yǎng)。
A.4 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)
成分: 蛋白胨 10.0g
葡萄糖 40.0g
瓊脂 15.0g
水 1000mL
制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為5.6后的培養(yǎng)。
A.5 SCDLP液體培養(yǎng)基
成分: 胰酪胨 17.0g
大豆蛋白胨 3.0g
氯化鈉 5.0g
磷酸氫二鉀 2.5g
葡萄糖 2.5g
卵磷脂 1.0g
吐溫 80 7.0g
水 1000mL
制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌20min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.2后的培養(yǎng)。
A.6 Eugon LT 100 肉湯
成分: 胰蛋白胨 15.0g
大豆蛋白胨 5.0g
氯化鈉 4.0g
L-胱氨酸 0.7g
亞硫酸鈉 0.2g
葡萄糖 5.5g
卵磷脂 1.0g
吐溫 80 5.0g
辛基酚聚醚-9 1.0g
水 1000mL
制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.0后的培養(yǎng)。
A.7 D/E肉湯
成分: 酵母浸粉 2.5g
胰蛋白胨 5.0g
葡萄糖 10.0g
亞硫酸氫鈉 2.5g
卵磷脂 7.0g
硫代硫酸鈉 6.0g
溴甲酚紫 0.02g
硫乙醇酸鈉 1.0g
吐溫 80 5.0g
水 1000mL
制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.6后的培養(yǎng)。
A.8 改良Letheen肉湯
成分: 牛肉浸粉 5.0g
氯化鈉 5.0g
卵磷脂 0.7g
吐溫 80 5.0g
酵母浸粉 2.0g
亞硫酸氫鈉 0.1g
酪蛋白胰酶水解物 5.0g
肉類胃蛋白酶水解物 20.0g
水 1000mL
制法：將各成分加入蒸餾水或純化水中，攪拌后加熱溶解，必要時調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH值為7.2后的培養(yǎng)。
化妝品防腐劑挑戰(zhàn)試驗技術(shù)指南（征求意見稿）起草說明
為加強化妝品的監(jiān)督管理，進一步提高化妝品使用安全性，中國食品藥品檢定研究院組織開展了化妝品微生物學防腐效能評價的研究制訂工作。現(xiàn)就工作有關(guān)情況說明如下：
一、起草原則
本標準規(guī)定了化妝品防腐效能的評價方法，適用于親水性的膏、霜、乳劑及水劑類等常見化妝品防腐體系效能評價。為保證評價方法的科學性，本次驗證在樣品選擇上不僅涵蓋了市場上不同防腐體系的化妝品，而且覆蓋了不同的類別，同時組織6家實驗室進行協(xié)作驗證，充分考量了實測數(shù)據(jù)的可靠性、重復性和準確性。
二、起草過程
化妝品標準專家委員會于2024年1月委托開展了化妝品微生物學防腐效能評價方法的制定工作。由中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）負責牽頭驗證，廣東省藥品檢驗所、湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院、上海市食品藥品檢驗研究院、四川省藥品檢驗研究院（四川省醫(yī)療器械檢測中心）、浙江省食品藥品檢驗研究院、江西省檢驗檢測認證總院食品檢驗檢測研究院6家外部實驗室進行實驗室間驗證工作，同時組織花王（中國）研究開發(fā)中心有限公司、北京寶潔技術(shù)有限公司、資生堂（中國）投資有限公司、華熙生物科技股份有限公司、上海家化聯(lián)合股份有限公司、聯(lián)合利華（中國）有限公司上海分公司、皮爾法伯(上海)化妝品貿(mào)易有限公司、袋鼠媽媽:廣州天然國度生物科技有限公司、諾斯貝爾化妝品股份有限公司、養(yǎng)生堂(安吉)化妝品有限公司參與項目調(diào)研、文本討論及驗證工作。前期準備工作包括查閱文獻、參考相關(guān)的國家和行業(yè)標準、研究實驗方案、化妝品樣品的篩選、方法驗證用菌株的制備和中和劑的篩選等。擬定驗證化妝品樣品和驗證方法后，開展了實驗室間的協(xié)作驗證，根據(jù)項目中期專家及企業(yè)的意見，完善了評價方法，整理了實驗數(shù)據(jù)和分析結(jié)果，經(jīng)整理歸納后，最終形成了化妝品防腐效能評價文本和驗證報告。
三、國內(nèi)外相關(guān)標準情況
目前我國用于化妝品防腐效能評價的標準是團體標準T/SHRH 017-2019 化妝品防腐挑戰(zhàn)實驗和T/GDCDC 010-2019 化妝品防腐挑戰(zhàn)性測試方法和《中華人民共和國藥典》（2020版）通則1121抑菌效力檢查法。
國際上主要用于化妝品防腐效能評估的標準為Cosmetics—Microbiology—Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product （ISO11930-2019），CTFA microbiology guidelines（2007），AOAC Officaial Method 998.10 Efficacy of Preservation of Non-Eye Area Water-Miscible Cosmetic and Toiletry Formulations, USP 43-NF 38<51> ANTIMICROBIAL EFFECTIVENESS TESTING。
表1 主要相關(guān)標準列表
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序號
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來源國家或組織
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標準號/版本號
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標準名稱
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檢測范圍/適用基質(zhì)
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與制修訂標準的關(guān)系
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1
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中華人民共和國藥典委員會
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2020版
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《中華人民共和國藥典》通則1121抑菌效力檢查法。
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藥品
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非等效
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2
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上海日用化學品行業(yè)協(xié)會
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T/SHRH 017-2019
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化妝品防腐挑戰(zhàn)實驗
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化妝品
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非等效
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3
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廣東省日化商會
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T/GDCDC 010-2019
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化妝品防腐挑戰(zhàn)性測試方法
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化妝品
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非等效
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4
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國際標準化組織
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ISO11930-2019
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Cosmetics—Microbiology—Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product
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化妝品
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非等效
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5
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美國分析化學家協(xié)會
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AOAC 998.10-2009
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Efficacy of Preservation of Non-Eye Area Water-Miscible Cosmetic and Toiletry Formulations
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化妝品
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非等效
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6
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美國藥典委員會
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USP 43-NF 38<51>
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ANTIMICROBIAL EFFECTIVENESS TESTING
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化妝品
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非等效
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四、實驗室驗證情況
本次評價方法的驗證實驗主要參考了Cosmetics—Microbiology—Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product （ISO11930-2019）和《中華人民共和國藥典》（2020版）的方法。驗證部分可分為樣品菌落總數(shù)和霉菌酵母菌檢測、中和劑效果驗證測試以及供試品防腐效能的測試三部分。
在本次前期驗證過程中，對40批次的化妝品產(chǎn)品進行了菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌的檢驗。檢驗結(jié)果表明，所有批次的化妝品的菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌的計數(shù)均＜10 CFU/g（mL）。中和劑驗證結(jié)果顯示，在1：100稀釋度內(nèi)，所有化妝品均能被有效中和。
在本次防腐效能測試時，選用了ATCC菌株及CMCC菌株同時開展實驗。結(jié)果顯示，來自不同菌種庫的菌株存在測試結(jié)果不一致的情況?？紤]到《中華人民共和國生物安全法》的實施，導致從合法途徑獲取ATCC菌株難度的增大，本次防腐效能評價測試最終選用了中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心來源的CMCC菌株作為標準菌株。中檢院采用CMCC菌株進行的防腐效能評價的結(jié)果顯示，除1個樣品外，其余樣品在各個時間點的測試結(jié)果均滿足防腐效能評價的要求，成功通過防腐效能評價測試。經(jīng)過分析，該樣品可被歸類為包裝不可開啟產(chǎn)品，無需進行防腐效能評價。因此本次試驗結(jié)果中可排除該結(jié)果數(shù)值。
基于6家實驗室的防腐效能測試結(jié)果來看，不同來源的菌株對個別供試品的防腐評價結(jié)果可能產(chǎn)生影響，這與中檢院的測試結(jié)果一致，進一步確認了在同一個標準中，不應(yīng)使用兩套菌株體系進行評價。6家實驗室防腐效能結(jié)果顯示，共有4個樣品不符合防腐效能評價的要求。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，其中一個樣品為袋裝式面膜產(chǎn)品，屬于一次性化妝品，無需進行防腐效能評價。因此，實際未能通過防腐效能評價的樣品共3個。綜合考慮中檢院及6家實驗室的數(shù)據(jù)，本次驗證試驗僅有7.5%（3/40）的化妝品無法滿足防腐效能評價要求，這一比例較低，對行業(yè)影響較小，能夠滿足標準制定的需求。
五、其他應(yīng)予以說明的事項
在制定化妝品防腐效能評價方法時，我們綜合考慮了國內(nèi)外相關(guān)標準，并創(chuàng)新性地引入了T1時間點和表皮葡萄球菌兩個關(guān)鍵要素，以限制防腐成分的過度使用。經(jīng)驗證，僅有1個樣品（2.5%，1/40）未能滿足T1時間點的要求，對行業(yè)影響較小。經(jīng)過方法學驗證，本方法的制定能夠滿足化妝品防腐效能評價的要求。
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