最近CDMO樣品分析出了點(diǎn)問(wèn)題，有個(gè)樣品客戶要求純度98%。但是盡管TLC點(diǎn)板子是單點(diǎn)，HPLC純度卻一直達(dá)不到要求。本來(lái)已經(jīng)比較煩了，結(jié)果送HPLC外檢的機(jī)構(gòu)也給我出幺蛾子，收到樣品不測(cè)壓了幾天不說(shuō)，檢測(cè)時(shí)一會(huì)波長(zhǎng)給我用200 nm，一會(huì)波長(zhǎng)又給我用210 nm，導(dǎo)致二次重結(jié)晶出來(lái)的樣品純度竟然比一次重結(jié)晶的還要差，也不知道是放壞了還是檢測(cè)有問(wèn)題，反正直接把我給整破防了。
我是有意跟檢測(cè)那邊懟一頓的，找了好多材料，老板意思卻是讓我別的別管，繼續(xù)重結(jié)晶（昨天換溶劑結(jié)了第七、八、九次圖片），所以……把找到的認(rèn)為好的材料跟大家分享一下吧！
關(guān)于高效液相首選等度洗脫，流動(dòng)相比例越簡(jiǎn)單越好，能不用緩沖鹽就不用，洗脫方法越簡(jiǎn)單越好、色譜柱越常見(jiàn)越好，但是有的時(shí)候用單一比例的流動(dòng)相或者是常見(jiàn)色譜柱是無(wú)法滿足很多雜質(zhì)的分離，這時(shí)就需重新開(kāi)發(fā)色譜分離方式。下面為一些分析條件開(kāi)發(fā)的個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)，希望給新入行的朋友一些實(shí)驗(yàn)靈感。
一、化合物性質(zhì)&洗脫方式
1、首先需要明白待分離雜質(zhì)的一些性質(zhì)，比如說(shuō)分子量、結(jié)構(gòu)式（主要看有哪種基團(tuán)），以及該種物質(zhì)在哪種有機(jī)溶劑中易溶解。結(jié)構(gòu)式對(duì)于分子極性大小的預(yù)測(cè)以及判定該物質(zhì)是否容易水解有非常重要的作用。
例如我們常見(jiàn)的-NHR、-COOH、-OH等都是比較常見(jiàn)的極性基團(tuán)；而常見(jiàn)的苯環(huán)、-CH=、-CH3等都是常見(jiàn)的非極性基團(tuán)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)可以大致的判斷一下物質(zhì)的極性，預(yù)估一下在常用的色譜柱上是否保留，再結(jié)合雜質(zhì)在各種常見(jiàn)洗脫溶劑中的溶解性，例如在甲醇、乙腈、正己烷中哪個(gè)比較易溶，選擇適合用于洗脫的有機(jī)流動(dòng)相，從而確定方法開(kāi)發(fā)時(shí)是用正相色譜柱或者是反向色譜柱做出粗略判斷。
2、確定正反相洗脫方式確定洗脫方式后，反向的話個(gè)人推薦先用60%的乙腈或者是甲醇，先去看一下你需要分離的幾種物質(zhì)能否被分開(kāi)，（正相洗脫方式思路相近）。在能分開(kāi)的前提下，再看一下最后一個(gè)峰的出峰時(shí)間，如果時(shí)間比較長(zhǎng)的話，再根據(jù)前幾個(gè)峰的分離度確定是否需要加大或者縮小有機(jī)相的比例。我們常見(jiàn)的洗脫分離方式為反相分離，而反相洗脫方式又分為兩種體系，一種是甲醇-水體系，另外一種是乙腈-水體系。具體是選擇哪種反相洗脫體系需要根據(jù)以下條件來(lái)決定：
A、乙腈的洗脫能力要優(yōu)于甲醇，在同等濃度、樣品下乙腈-水體系的目標(biāo)峰出峰要快于甲醇-水體系。
B、甲醇溶于水是會(huì)放出熱量的，乙腈溶于水是會(huì)吸熱的，在同等方式的梯度洗脫方式下，在兩種流動(dòng)相互相混合時(shí)由于分子熱運(yùn)動(dòng)的原因，甲醇溶于水比乙腈溶于水時(shí)的分子熱運(yùn)動(dòng)劇烈，這樣兩種流動(dòng)相的混合會(huì)更加均勻，反映在基線上的表現(xiàn)為基線更加的平滑，且梯度峰要更少。
C、甲醇在市面上的售價(jià)要遠(yuǎn)低于乙腈（如果財(cái)大氣粗的公司可以忽略這一條）。
D、甲醇的分子量大于乙腈，在同一色譜柱、相同濃度的有機(jī)相濃度下，乙腈-水體系的柱壓更小。
E、甲醇的截止吸收波長(zhǎng)在210nm附近，而乙腈的截止吸收波長(zhǎng)在190nm附近，在檢測(cè)波長(zhǎng)遠(yuǎn)離210nm的時(shí)候選擇甲醇或是乙腈-水體系主要看其它影響因素。但是測(cè)定波長(zhǎng)在210nm附近時(shí)，由于甲醇的截止吸收波長(zhǎng)大于乙腈，除了流動(dòng)相不同外，相同的測(cè)定條件下，乙腈-水體系測(cè)定的樣品響應(yīng)值更高，從而能夠得到更小樣品檢出限，此時(shí)建議優(yōu)選乙腈-水體系。
二、色譜柱&流速&柱溫
實(shí)驗(yàn)室分析中最常用的就是類型的色譜柱，一般為5 μm 0.46×250 mm或者是0.46×150 mm，在試驗(yàn)前期如果在沒(méi)有參考資料的情況下，首選最為普通的 5 μm 0.46×250 mm的色譜柱試一下；如果發(fā)現(xiàn)用5 μm 0.46×250 mm的色譜柱去分離多種雜質(zhì)時(shí)，有分叉峰出現(xiàn)或是理論塔板數(shù)比較低時(shí)則提示我們這種類型的色譜柱對(duì)該物質(zhì)的分離是不太好的，需要我們更換柱效更高的色譜柱，通常選擇粒徑、填料更小的色譜柱，這個(gè)需要根據(jù)實(shí)際情況，進(jìn)行試驗(yàn)后確定適用于檢測(cè)的色譜柱。
而流速的選擇通常是要根據(jù)色譜柱的具體類型，最高的耐受壓力來(lái)決定，常用的色譜柱一般流速為1.0 mL/min，其實(shí)流量對(duì)雜質(zhì)分離的影響比較小。柱溫首選室溫，柱溫的升高會(huì)影響雜質(zhì)的出峰快慢，理論上柱溫越高，各種物質(zhì)的出峰會(huì)越快，同時(shí)色譜柱的柱壓也會(huì)越小，但是由于溫度比較高會(huì)導(dǎo)致色譜柱中填料的健合相容易被流動(dòng)相沖刷下來(lái)，導(dǎo)致色譜柱不可逆的柱效下降。因此色譜柱溫度不宜過(guò)高，一般溫度設(shè)定為25~35 ℃，當(dāng)然也有特殊的品種有的需要柱溫在40 ℃甚至更高。
三、梯度洗脫程序
在選擇好用正反相洗脫方式、確定用的色譜柱、柱溫、流速后，無(wú)論如何調(diào)整梯度及流動(dòng)相比例都無(wú)法將兩種雜質(zhì)分離開(kāi)后，那么就需要用到梯度洗脫方式。梯度洗脫是一種在不同的時(shí)間加入不同有機(jī)比例流動(dòng)相的一種洗脫方式。與傳統(tǒng)的等度相洗脫方式比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
A、能夠增加兩種物質(zhì)的分離度，通過(guò)不同時(shí)間段加入有機(jī)相濃度的不同，使雜質(zhì)在不同時(shí)間段受到有機(jī)相洗脫的濃度不同，一般原則是逐步增加有機(jī)相的比例，從而使難被洗脫出來(lái)的雜質(zhì)加快出峰。
B、由于可以調(diào)整有機(jī)相加入的濃度，與等度洗脫相比，可以縮短分析時(shí)間，還可以一次性將等度洗脫分不開(kāi)的幾種物質(zhì)分開(kāi)，從而用一種分析方法分析多種物質(zhì)，降低成本。梯度洗脫程序的摸索過(guò)程，需要遵循以下原則：
原則一：不使用單一流動(dòng)相初級(jí)實(shí)驗(yàn)者梯度洗脫的時(shí)候，流動(dòng)相A一般為緩沖鹽，流動(dòng)相B一般為純的有機(jī)相。但是高級(jí)實(shí)驗(yàn)者使用的A相往往不單純使用緩沖鹽，而是要加入一定比例的有機(jī)相，原因有兩個(gè)。第一是加入最少5%的甲醇/乙腈可以防止流動(dòng)相長(zhǎng)菌。第二是加入一定比例的有機(jī)相可以減小在儀器進(jìn)行流動(dòng)相A、B相互混合時(shí)造成的基線波動(dòng)，使基線更加平滑。至于流動(dòng)相B到底是否是選擇純的有機(jī)相還是選擇一定比例的有機(jī)相例如（80%、90%的甲醇或乙腈）要根據(jù)實(shí)驗(yàn)去做選擇。推薦用一定比例的有機(jī)相為流動(dòng)相B。因?yàn)樵诩尤爰兊囊译婊蛘呒状嫉扔袡C(jī)相時(shí)，由于兩相在混合時(shí)會(huì)有吸熱或放熱的反應(yīng)，會(huì)有很大的基線波動(dòng)，用一定比例的有機(jī)相作為B相可以有效地減小流動(dòng)相沖擊效應(yīng)。
原則二：有機(jī)相加入梯度梯度盡量緩。
關(guān)于梯度鬼峰的出現(xiàn)，如果純的緩沖鹽相與有機(jī)溶劑相相互混合時(shí)，會(huì)有很大的互溶沖擊效應(yīng)的出現(xiàn)，這時(shí)候即使安裝市面上的比較常用的鬼峰捕集小柱，基線依然不是很平滑；所以我推薦用混合一定比例的有機(jī)相與鹽相的溶液作為混合鹽相，將混有一定比例水的有機(jī)相的混合液作為梯度洗脫的有機(jī)相，配合鬼峰捕集小柱的使用可以使基線更加平滑。
四、緩沖鹽
首先要明白為什么要加入緩沖鹽，緩沖鹽的作用之一是為了增加流動(dòng)相的緩沖能力。一般常見(jiàn)的無(wú)機(jī)緩沖鹽（磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫氨、乙酸銨等）的作用是為了調(diào)整流動(dòng)相的緩沖能力；
何為緩沖能力？緩沖能力是指在其他溶液或者物質(zhì)加入到流動(dòng)相后，流動(dòng)相pH變化程度的大小，流動(dòng)相的pH變化越小證明流動(dòng)相的緩沖能力越強(qiáng)，反之越弱。在一些標(biāo)準(zhǔn)上可以看到同一流動(dòng)相的配置過(guò)程中需要使用的緩沖鹽有兩種，這是因?yàn)槭褂脧?fù)合鹽作為流動(dòng)相比使用單一的鹽作為流動(dòng)相的緩沖能力強(qiáng)。
有些待測(cè)主成分在中性或者堿性的環(huán)境中容易水解，例如帶-OH的基團(tuán)，容易在中性、堿性環(huán)境中水解，在圖譜上表現(xiàn)為雙頭峰。為防止這種類型的水解，可以加入磷酸鹽用磷酸調(diào)節(jié)pH至酸性環(huán)境，從而抑制水解。
加入緩沖鹽的另外作用是為了增加待測(cè)成分的保留時(shí)間，通常帶有氨基的物質(zhì)或者氨根的物質(zhì)如-、-NHR、-等基團(tuán)時(shí)，為了增加該物質(zhì)的保留，可以添加-（硫酸基）的離子對(duì)試劑如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉，以增強(qiáng)保留。一般來(lái)說(shuō)緩沖鹽是不會(huì)出峰的，我曾經(jīng)用pH調(diào)為3.0的水為流動(dòng)相與用磷酸二氫鉀為緩沖鹽pH調(diào)為3.0的水溶液作為流動(dòng)相，兩者圖譜出來(lái)的梯度峰吻合度非常好，所以各位同仁不必?fù)?dān)心緩沖鹽會(huì)造成梯度峰。造成梯度峰的直接原因是流動(dòng)相混合沖擊。
五、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
關(guān)于檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，需要結(jié)合多個(gè)雜質(zhì)的紫外吸收?qǐng)D譜去綜合考量，最好選擇紫外吸收特征圖譜上波峰處的波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，但是也要兼顧其它雜質(zhì)在該波長(zhǎng)下是否有紫外吸收。
以上述圖譜中三個(gè)雜質(zhì)為例，可以看出3個(gè)雜質(zhì)的最大吸收分別為203.3、204.5、204.5nm，同時(shí)在205~230nm這個(gè)范圍內(nèi)也可以作為次選波長(zhǎng)。所以綜合考慮該三個(gè)雜質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)可以暫定為205nm。
波長(zhǎng)選擇需要注意的點(diǎn)：190~210nm這個(gè)范圍內(nèi)的波長(zhǎng)慎重選擇，該波段的波長(zhǎng)屬于低波段，受到的干擾比較多，尤其是受流動(dòng)相中試劑的純度影響較大。如果遇到試劑不純或者水質(zhì)不好時(shí)，就會(huì)有一個(gè)類似梯度峰的“峰”出現(xiàn)，此類峰往往比較平滑，并不像真正雜質(zhì)的峰那樣尖銳，同時(shí)表現(xiàn)為無(wú)論如何調(diào)整梯度洗脫程序，始終在特定的位置“出峰”。如果該“峰”恰巧影響雜質(zhì)出峰，那么消除起來(lái)就非常難了。筆者曾經(jīng)遇到的一個(gè)項(xiàng)目就被這種峰糾纏了好久，后來(lái)通過(guò)更換更高級(jí)別的試劑、更純凈的水、多次沖洗儀器、色譜柱，逐步排除后才解決問(wèn)題，我曾試驗(yàn)過(guò)，用DAD檢測(cè)器選用265nm、225nm、205nm分別作為檢測(cè)波長(zhǎng)，該“峰”在265nm、225nm不會(huì)出現(xiàn)，所以205這個(gè)波長(zhǎng)慎重選擇。
六、溶劑
如果用等度洗脫，首選用流動(dòng)相作為溶劑，一般直接用流動(dòng)相為稀釋劑已經(jīng)足夠滿足日常分析要求。但對(duì)于梯度洗脫方式，最好選擇與初始梯度濃度相近溶液作為溶劑；但是不管是等度還是梯度洗脫，都要需要考慮以下幾點(diǎn)；
第一是溶劑對(duì)樣品的溶解能力，如果所選的溶劑對(duì)樣品的溶解能力不足，輕則不出峰，重則堵儀器、色譜柱。
第二是需要考慮溶劑出峰是否會(huì)對(duì)目標(biāo)峰的分離造成影響，如果溶劑峰影響目標(biāo)峰出峰，那么所選的溶劑肯定是不合適的。對(duì)于梯度洗脫溶劑的選擇，可以通過(guò)逐步調(diào)節(jié)溶劑中有機(jī)相與鹽相的比例，觀察圖譜來(lái)選擇合適的溶劑，同時(shí)要注意溶劑的pH、緩沖能力要盡可能的與流動(dòng)相相當(dāng)。我們一直說(shuō)的溶劑峰到底是個(gè)什么鬼？很多同仁做了很多年實(shí)驗(yàn)也沒(méi)有真正的搞清楚，溶劑峰是由于溶劑中有機(jī)相與初始流動(dòng)相中有機(jī)相的不同，二者在進(jìn)樣后由于其極性不一樣，在同一波長(zhǎng)下吸光度不一樣而導(dǎo)致的“出峰”，一般通過(guò)改變測(cè)定波長(zhǎng)可以掩蔽溶劑峰的出現(xiàn)與否。
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
