目前溶出方法開發(fā)及驗(yàn)證方面，USP<1092>講解的較為詳細(xì)，本文中的驗(yàn)證一般要求，主要是參考了目前USP 2023版本的內(nèi)容。在國(guó)內(nèi)的指導(dǎo)原則，也明確指出了仿制藥溶出曲線檢測(cè)應(yīng)該進(jìn)行必要的驗(yàn)證，如《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》，指出“溶出試驗(yàn)方法應(yīng)能客觀反映制劑特點(diǎn)、具有適當(dāng)?shù)撵`敏度和區(qū)分力”，“方法建立后應(yīng)進(jìn)行必要的驗(yàn)證，如：準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、線性、范圍和耐用性等”；《化學(xué)藥品仿制藥口服固體制劑質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)申報(bào)資料要求（試行）》指出“體外溶出曲線測(cè)定方法（含多個(gè)溶出介質(zhì)）建立后，按照中國(guó)藥典2015版四部附錄〈9101〉藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行必要的方法學(xué)驗(yàn)證，如：準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、線性、范圍和耐用性等。”。
溶出曲線的驗(yàn)證與溶出度相比，主要區(qū)別在于范圍。溶出曲線以第一個(gè)溶出點(diǎn)為低限，最終溶出量為高限；溶出度以標(biāo)準(zhǔn)溶出量為中間點(diǎn)進(jìn)行研究，相比溶出度，溶出曲線的研究范圍要寬一些。
以溶出度方法學(xué)驗(yàn)證為列，以下是我對(duì)于溶出方法學(xué)驗(yàn)證的個(gè)人總結(jié)。
一、參考依據(jù)
溶出方法學(xué)較一般的含量方法學(xué)驗(yàn)證，除了需要驗(yàn)證分析（檢測(cè)）方法，還需要驗(yàn)證溶出（溶出過程）方法。對(duì)于完整的溶出度方法學(xué)驗(yàn)證，主要參照中國(guó)藥典、美國(guó)藥典以及ICH文件，如下：
● 中國(guó)藥典2020版，9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則。溶出度分析方法驗(yàn)證指標(biāo)包括：專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性和范圍、耐用性。
● USP〈1225〉 Validation of Compendial Procedures。
CATEGORY III：Analytical procedures for determination of performance characteristics (e.g., dissolution, drug release, and others).
● USP〈1092〉 The Dissolution Procedure Development And Validation。分析方法驗(yàn)證指標(biāo)包含專屬性、線性和范圍、準(zhǔn)確度、精密度、耐用性；溶出方法驗(yàn)證指標(biāo)包含精密度、耐用性。溶出方法學(xué)驗(yàn)證使用具有代表性的均一樣品。
● 【中文】ICH Q2（R2）：分析方法驗(yàn)證（草案）（2023.11.01采納，2024年CDE發(fā)布的中文翻譯稿）。對(duì)其他定量測(cè)定，做出了說明，“如果工作范圍接近技術(shù)的檢測(cè)限度或定量限度，則其他定量測(cè)定可遵循雜質(zhì)檢查方案，否則建議遵循含量測(cè)定方案”。同時(shí)將速釋制劑的溶出度方法學(xué)驗(yàn)證作為其中的示例，溶出步驟的驗(yàn)證指標(biāo)為精密度、耐用性；分析方法的驗(yàn)證指標(biāo)為專屬性/選擇性、線性和范圍、準(zhǔn)確度、精密度、耐用性，其中范圍下限是根據(jù)具體情況而定，如果工作范圍下限接近定量限，是需要驗(yàn)證定量限的。
二、方法學(xué)驗(yàn)證過程
（一）專屬性
目的證明溶出介質(zhì)與輔料對(duì)樣品檢測(cè)無干擾；驗(yàn)證過程及可接受標(biāo)準(zhǔn)來源 USP<1092>。
溶液配制
空白溶液：取溶出介質(zhì)，按照供試品的處理方式進(jìn)行處理（如過濾等）。
空白輔料溶液：取空白輔料混合樣品（含包衣粉、膠囊殼）適量（按處方比例及介質(zhì)體積換算），在37℃的條件下，在溶出介質(zhì)中溶解或分散，按照供試品的處理方式進(jìn)行處理（如過濾等）。
供試品溶液：取空白輔料混合樣品適量（按處方比例及介質(zhì)體積換算；緩控釋制劑，更建議采用空白制劑的方式進(jìn)行），在37℃的條件下，加入溶出介質(zhì)溶解或分散，按處方比例加入適量原料藥，使完全溶解（為確保溶解完全，也可按處方比例加入適量的原料藥貯備液），按照供試品的處理方式進(jìn)行處理（過濾等）。
其他：當(dāng)樣品在介質(zhì)中不穩(wěn)定，存在顯著降解，需要增加降解物的干擾實(shí)驗(yàn)。
使用紫外法時(shí)：空白溶液測(cè)定，扣除比色皿+空氣空白；空白輔料溶液測(cè)定，扣除溶出介質(zhì)空白；空白溶液測(cè)定時(shí)，扣除輔料空白。
上述供試品溶液，也可以用對(duì)照品溶液代替，按照以下計(jì)算公式計(jì)算干擾：
Result = (AP/AS) × CS × (V/L) × 100
AP=空白的吸光度值或響應(yīng)值
AS=供試品溶液的吸光度值或響應(yīng)值
CS=供試品溶液的主成分濃度（mg/ml）
V=介質(zhì)體積
L=標(biāo)示量（mg）
可接受標(biāo)準(zhǔn)
HPLC法：溶出介質(zhì)、輔料均不干擾主峰檢出；主峰純度應(yīng)符合要求。
UV法：按上述計(jì)算方式，溶出介質(zhì)干擾應(yīng)不超過1%；空白輔料干擾不得過2%。
（二）定量限/檢測(cè)限
應(yīng)根據(jù)最小溶出量、釋放量決定是否需要進(jìn)行檢測(cè)限/定量限考察。一般，緩控釋制劑以及遲釋制劑不釋放或幾乎不釋放的溶出介質(zhì)中考察；速釋制劑無需進(jìn)行該研究。需不需要做定量限可參照下述線性與范圍項(xiàng)下的描述。
HPLC法：采用對(duì)照品，用相應(yīng)的溶出介質(zhì)逐步稀釋進(jìn)樣。LOD信噪比2:1或3:1；LOQ信噪比10:1。
UV法：按照公式計(jì)算。
LOD = 3.33δ /S ；LOQ = 10δ /S。
式中，δ：響應(yīng)值的偏差；S : 標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。
δ可以通過下列方法測(cè)得：① 測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；②標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
可接受標(biāo)準(zhǔn)
定量限定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。連續(xù)進(jìn)樣6針定量限溶液，主峰峰面積RSD≤10%。（也可根據(jù)中國(guó)藥典9101指導(dǎo)原則，表3 樣品中待測(cè)定成分的含量與精密度可接受范圍關(guān)系，制定相應(yīng)的RSD值要求）
（三）線性和范圍
線性溶液配制：可用一貯備液經(jīng)溶出介質(zhì)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列被測(cè)物質(zhì)濃度系列進(jìn)行測(cè)定，至少制備5個(gè)濃度。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)作為被測(cè)物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。
應(yīng)注意，如果對(duì)照品/原料藥不易溶解，可考慮添加有機(jī)溶劑溶解制備貯備液，但最終線性溶液中有機(jī)溶劑的使用體積應(yīng)小于5%。
可接受標(biāo)準(zhǔn)
r≥0.99（r2≥0.98，USP）
范圍：一般，溶出度限度的+20%，如規(guī)定限度范圍，線性范圍則為下限-20％至上限+20％。線性范圍下限接近0%，應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)限/定量限的考察，線性范圍的下限應(yīng)為定量限。詳細(xì)可參照下述各指導(dǎo)原則等，考察線性范圍。
（四）回收率
溶液配制
對(duì)照品溶液配制：按照擬定方法進(jìn)行配制。
供試品溶液配制：取所有混合輔料（溶出檢測(cè)方法下的供試品100%濃度水平，應(yīng)包含包衣粉、膠囊殼等），在37℃的條件下，加入對(duì)照品或已知含量的原料藥配制3種濃度，每種濃度3份樣品，加入溶出介質(zhì)溶解，按擬定的供試品的處理方式進(jìn)行處理（如過濾等）。加入對(duì)照品或原料藥的方式，可以為逐份準(zhǔn)確稱量，也可以先配制貯備液，精密量取適量體積的方式進(jìn)行。如使用有機(jī)溶劑制備貯備液，貯備液總有機(jī)溶劑體積含量應(yīng)不超過5%。
3種濃度一般分別為線性范圍的低限、限度濃度（100%濃度）、線性范圍的高限
計(jì)算公式：回收率=測(cè)得量/加入量×100%
可接受標(biāo)準(zhǔn)
回收率范圍95.0%~105%（標(biāo)準(zhǔn)來源USP<1092>）
其他情況：對(duì)于特殊情況，如USP<711>中所述，第一階段釋放量不超過10%，第二階段釋放量不超過25%等，做回收率試驗(yàn)具有挑戰(zhàn)性，可參照USP<1092>/5.Validating/5.3 Accuracy/Recovery項(xiàng)下內(nèi)容。
（五）精密度
精密度試驗(yàn)分為分析方法的精密度試驗(yàn)與溶出方法的精密度試驗(yàn)?？蓞⒄誌CH Q2（R2）、USP<1092>中的內(nèi)容。ICH Q2中區(qū)分了溶出方法的精密度試驗(yàn)、分析方法的精密度試驗(yàn)，溶出方法的精密度試驗(yàn)使用一批具有代表性的制劑考察，分析方法的精密度考察使用1片制劑進(jìn)行考察，備注中說明溶出方法的精密度研究將允許對(duì)制劑和分析的變異性進(jìn)行綜合評(píng)估 ；USP中中間精密度對(duì)溶出方法和分析方法進(jìn)行綜合評(píng)估，未給出具體的可接受標(biāo)準(zhǔn)。
精密度（分析方法）
重復(fù)性樣品配制
對(duì)照品溶液：按照擬定方法進(jìn)行配制。
供試品溶液配制：
第一種方法（見ICH Q2（R2））：使用1個(gè)/片/粒制劑，用溶出介質(zhì)完全溶解后，按照供試品處理方式（如過濾等）配制6個(gè)樣品；
第二種方法：與100%回收率樣品配制方法一致，配制6份樣品。
重復(fù)性可接受標(biāo)準(zhǔn)（分析方法）
同一對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針（HPLC法）/測(cè)定6次（紫外分光光度法），6次對(duì)照品溶液的響應(yīng)值（峰面積或吸光度值），RSD＜1%；測(cè)得6份供試品溶液的溶出量，RSD＜2%（USP2023 <1092>）。
中間精密度樣品配制
不同試驗(yàn)員、不同日期、不同液相/紫外分光光度計(jì)，按照上述重復(fù)性操作過程，配制溶出介質(zhì)及樣品。
中間體精密度可接受標(biāo)準(zhǔn)（分析方法）
12份供試品溶液的溶出量，RSD＜2%。
精密度（溶出方法）
重復(fù)性樣品配制
對(duì)照品溶液：按照擬定方法進(jìn)行配制。
供試品溶液配制：使用有代表性的均一產(chǎn)品，以溶出度檢測(cè)方法進(jìn)行研究。取6片，使用溶出儀配制的溶出度樣品并依據(jù)擬定方法檢測(cè)。
注：如果沒有合適的產(chǎn)品，可以使用原料藥+輔料的形式，進(jìn)行檢測(cè)。
重復(fù)性可接受標(biāo)準(zhǔn)（溶出方法）
溶出度RSD不超過10%，溶出量較低的情況可放寬至20%
中間精密度樣品配制
不同試驗(yàn)員、不同日期、不同溶出儀、不同液相/紫外分光光度計(jì)，按照上述重復(fù)性操作過程，配制溶出介質(zhì)及樣品。
中間精密度可接受標(biāo)準(zhǔn)（溶出方法）
12份溶出度RSD不超過10%，溶出量較低的情況可放寬至20%；
溶出度<85%的情況，兩次檢測(cè)樣品的溶出度結(jié)果平均值的差值的絕對(duì)值不超過10%，溶出度不小于85%的情況，兩次檢測(cè)樣品的溶出結(jié)果的平均值差值的絕對(duì)值不超過5%。
說明：中間精密度溶出度差值的絕對(duì)值要求的來源為USP<1092>，5.4.2 INTERMEDIATE PRECISION/RUGGEDNESS；溶出度RSD值的要求參考USP<1092>，2. METHOD DEVELOPMENT，原文“One guidance defines dissolution results as highly variable if the relative standard deviation (RSD) is more than 20% at time points of 10 min or less and more than 10% at later time points for 12 dosage units tested”，如果RSD超出20%或10%認(rèn)為是高變異。這里參考的指南指的是USP<1092>參考文獻(xiàn)（15），詳細(xì)可查看USP<1092>。
（六）耐用性
耐用性同精密度一致，需要驗(yàn)證分析方法的耐用性和溶出方法的耐用性。
耐用性（分析方法）
樣品配制
對(duì)照品溶液：按照擬定方法。
供試品溶液：1份；使用制劑溶解或100%回收率的做法。
同一般分析方法學(xué)驗(yàn)證相同，液相色譜法中典型的變動(dòng)因素有流動(dòng)相的組成和pH值、不同品牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱、柱溫、流速等。USP<1225>提到了改變檢測(cè)波長(zhǎng)，目前國(guó)內(nèi)是不改變波長(zhǎng)的；對(duì)于紫外分光光度計(jì)法，一項(xiàng)變動(dòng)因素是檢測(cè)波長(zhǎng)。關(guān)于USP中描述原文見下方：
Robustness of analytical finish is referenced in <1225>. HPLC analysis parameters may include mobile phase composition (percentage organic, buffer concentration, pH), flow rate, wavelength, column temperature, and multiple columns (of the same type). For spectrophotometric analysis, the wavelength may be varied.
可接受標(biāo)準(zhǔn)（分析方法）
改變色譜條件后，與標(biāo)準(zhǔn)條件相比，應(yīng)在98%~102%范圍內(nèi)；每種條件下，系統(tǒng)適用性應(yīng)符合要求。
耐用性（溶出方法）
ICHQ2：選擇溶出方法參數(shù)的依據(jù)，例如，溶出介質(zhì)組成、緩沖劑或表面活性劑濃度、沉降片的使用、pH值、脫氣、容積、攪拌速率、采樣時(shí)間
USP<1092>
The parameters may include medium composition (e.g., buffer or surfactant concentration, pH, deaeration), volume, agitation rate, sampling time, and temperature. Statistical analysis of the data generated will help determine the extent to which the parameters must be controlled in the method.
參數(shù)可包括溶出介質(zhì)組成（如緩沖液或表面活性劑濃度、pH 值、脫氧）、體積、攪拌速率、取樣時(shí)間和溫度。
對(duì)于溶出方法的耐用性研究，可作為方法開發(fā)過程中的內(nèi)容。ICH與USP兩者基本一致，可作為參考。
樣品配制
對(duì)照品溶液：按照擬定方法。
供試品溶液：按照上述條件，每種條件從質(zhì)量均一的制劑中取6片制劑考察，計(jì)算溶出度。
可接受標(biāo)準(zhǔn)
每種條件下，6片制劑的溶出度，RSD＜2%。
改變?nèi)艹鰲l件后，與標(biāo)準(zhǔn)溶出條件下所測(cè)溶出度平均值相比，溶出度<85%的情況，差值的絕對(duì)值不超過10%，溶出度不小于85%的情況，差值的絕對(duì)值不超過5%。
（七）溶液穩(wěn)定性
考察供試品溶液的穩(wěn)定性，分別考察37℃、放置溫度（如室溫、冷藏等條件）兩種情況，考察對(duì)照品溶液、系統(tǒng)適用性溶液放置條件下的穩(wěn)定性?？疾鞎r(shí)間考慮多批次檢樣、樣品配制過程等情況。
可接受標(biāo)準(zhǔn)
與0時(shí)樣品響應(yīng)值相比，應(yīng)在98%~102%范圍內(nèi)。
三、溶出度、溶出曲線方法學(xué)驗(yàn)證項(xiàng)目總結(jié)
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