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RABS/隔離器系統(tǒng)在運(yùn)行過(guò)程中，手套是內(nèi)部A級(jí)環(huán)境和操作人員之間的關(guān)鍵通道，手套的破裂直接影響內(nèi)部的無(wú)菌環(huán)境。所以常規(guī)的手套完整性測(cè)試是強(qiáng)制性的，在生產(chǎn)過(guò)程中保證手套完整性的至關(guān)重要。

造成手套泄露的原因有很多：與鋒利表面/工具/破碎的瓶子接觸導(dǎo)致的機(jī)械破損、安裝過(guò)程中因手套與手套環(huán)安裝不到位導(dǎo)致的孔隙、手套長(zhǎng)期使用導(dǎo)致的老化破損。無(wú)論哪種原因在手套的任何位置上造成的孔隙都應(yīng)該被檢測(cè)到。

在2022版歐盟無(wú)菌附錄1中有如下描述：

FDA無(wú)菌生產(chǎn)指南中有如下描述：

歐盟無(wú)菌附錄1中要求藥企需要根據(jù)自己的手套選型定義完整性檢測(cè)的操作標(biāo)準(zhǔn)程序。但目前主流的實(shí)驗(yàn)室對(duì)于手套孔洞風(fēng)險(xiǎn)的研究或者或手套測(cè)試應(yīng)該用什么樣的參數(shù)進(jìn)行測(cè)試的研究很少，這就造成了藥企對(duì)于供應(yīng)商提供的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)法理解和把握，對(duì)后續(xù)手套完整性測(cè)試儀的確認(rèn)和驗(yàn)證造成困難。

因?yàn)榧?xì)菌能夠在任何壓力水平下通過(guò)孔生長(zhǎng)。細(xì)菌孢子的直徑低至1µm，而營(yíng)養(yǎng)桿菌和酵母的直徑可達(dá)10µm及以上。通過(guò)上述直徑，手套測(cè)試儀的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)似乎已經(jīng)給出（下圖展示了400µm厚手套膜10µm孔的比例）。但是，并沒(méi)有現(xiàn)有的物理測(cè)試方法能夠檢測(cè)直徑小于1µm的手套組件中的泄漏。更糟糕的是：可能無(wú)法在手套組件的每個(gè)位置檢測(cè)到100微米級(jí)的切口。

目前采用的手套材質(zhì)大多為“Hypalon”材質(zhì)， “Hypalon”具有分層結(jié)構(gòu)，隨著時(shí)間的推移，這種結(jié)構(gòu)往往容易剝落，從而導(dǎo)致手套膜出現(xiàn)不穩(wěn)定的穿孔（手套膜不僅表現(xiàn)出彈性行為，還具有粘性，特別是當(dāng)它受到張力或機(jī)械載荷的應(yīng)力時(shí)，這些應(yīng)力區(qū)域減小了膜厚度，并且對(duì)機(jī)械沖擊更敏感）。薄膜破裂通常是手套局部應(yīng)力過(guò)大的結(jié)果（化學(xué)品也有類似的效果：有些化學(xué)品能夠降低手套的強(qiáng)度）。

因?yàn)槭痔撞馁|(zhì)的特殊性，對(duì)于如何可以更好的使孔隙能被更合理的檢測(cè)/識(shí)別出來(lái)，Dr.Johannes Rauschnabel等人通過(guò)如下幾種方法進(jìn)行過(guò)研究：

在氮室中測(cè)量氧的含量：手套與一個(gè)特殊的袖套一起放入真空室，真空室被抽真空并充滿氮?dú)狻Ｈ绻l(fā)生泄漏，手套內(nèi)的空氣（含20%氧氣）會(huì)泄漏到腔室中，氣體傳感器會(huì)在腔室中測(cè)量氧氣水平。該水平可以與泄漏率相關(guān)。由于4000 Pa的高測(cè)試壓力，該程序非常敏感，并且非常準(zhǔn)確（驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)是500 ppm的氧氣濃度，這是指人造的40µm孔）。手套可以在生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行測(cè)試，但值得注意的是，該測(cè)試對(duì)整個(gè)手套組件提出了挑戰(zhàn)。

測(cè)量空氣流量：對(duì)手套進(jìn)行加壓，一定時(shí)間內(nèi)使手套維持600Pa。用流量計(jì)測(cè)量補(bǔ)償泄漏造成的壓力損失所需的每次空氣量，并將其與泄漏率相關(guān)聯(lián)。理論計(jì)算得出的最小驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)為2 ml/min，這將與大約66µm的孔徑相關(guān)。在實(shí)際測(cè)試中，這種方法只能達(dá)到最小100µm直徑的結(jié)果，但重現(xiàn)性較差。

壓力衰減測(cè)量：對(duì)手套（組件）進(jìn)行加壓，使手套（組件）膨脹。達(dá)到/通過(guò)一定的壓力水平，測(cè)量開始。過(guò)了一段時(shí)間，顯現(xiàn)結(jié)束壓力。根據(jù)壓降，可以計(jì)算出泄漏率。此測(cè)試的原理非常簡(jiǎn)單，只需要使用壓力表和秒表就可以進(jìn)行。但因?yàn)槭痔拙哂袕椥?，該方法可能缺乏可?fù)制性。

研究表明，在第III種方法中，如果使手套在高壓或更長(zhǎng)時(shí)間的加壓狀態(tài)下，手套會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N“平衡狀態(tài)”，從這種狀態(tài)可以將手套的行為視為恒定，這種非線性行為（手套彈性）的影響隨著應(yīng)力水平的降低而降低。但是維持高壓3000Pa或4000Pa是不能同時(shí)滿足手套和袖套同樣的形變進(jìn)行測(cè)試（手套主體變形，手指沒(méi)有變形），不能客觀反映泄露風(fēng)險(xiǎn)；而延長(zhǎng)加壓時(shí)間，單個(gè)手套組件達(dá)到測(cè)試條件可能需要數(shù)個(gè)小時(shí)。

根據(jù)研究，通過(guò)重復(fù)壓力脈沖使手套維持在1200Pa上下10-20min（根據(jù)手套厚度）可以很好的使手套進(jìn)入一個(gè)“平很狀態(tài)“（如下圖）。

通過(guò)對(duì)三組不同的新舊手套在不同壓力脈沖的時(shí)間下對(duì)比發(fā)現(xiàn)：

脈沖時(shí)間越長(zhǎng)，偏差越小。

壓力越高，可重現(xiàn)性越好（1200Pa被證明是標(biāo)準(zhǔn)手套/套筒組件的最佳壓力水平）。

結(jié)論：比較理想的用于壓力脈沖的測(cè)試壓力可以選定為1200Pa，也可以根據(jù)不同的手套型號(hào)選擇壓力脈沖時(shí)間。

有研究表明，當(dāng)操作員的手進(jìn)入手指套時(shí)，手套會(huì)產(chǎn)生高達(dá)500 Pa的瞬時(shí)加壓。這種瞬間的增壓產(chǎn)生一股射流，可能攜帶空氣中的微粒和微生物污染。Gessler等人曾研究量化了針孔與隔離器中工作或產(chǎn)品的潛在污染風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)

測(cè)試手套：在相同型號(hào)的手套（一共15個(gè)手套）的相同指尖位置模擬切割出不同的孔徑（1mm，2mm，3mm）

測(cè)試設(shè)備：兩個(gè)可以通過(guò)傳遞氣鎖連接的隔離器

測(cè)試物料：107CFU/ml ATCC 7953嗜熱脂肪芽孢桿菌懸浮液

測(cè)試步驟：

將要測(cè)試的手套安裝在兩個(gè)隔離器之間的傳遞氣鎖左側(cè)門的連接環(huán)上。

使用IPA對(duì)手套進(jìn)行清潔后，對(duì)兩個(gè)隔離器進(jìn)行VPHP凈化15分鐘。

停止VPHP凈化，并通風(fēng)將過(guò)氧化氫氣濃度降低至0 PPM。

在霧化器罐中充滿7毫升ATCC 7953的菌，并在右側(cè)隔離器中開始霧化。

排空霧化器罐，右室中的壓力增加到500Pa，模擬手進(jìn)入手套時(shí)產(chǎn)生的壓力，并促進(jìn)孢子通過(guò)手套。

布局如下圖：

微生物取樣：在孔周圍進(jìn)行擦拭取樣并在TSA中進(jìn)行培養(yǎng)。在左側(cè)隔離器壁上的計(jì)數(shù)觸盒進(jìn)行表面取樣。在58℃±2℃下培養(yǎng)2天后，評(píng)估是否存在菌落。

在評(píng)估測(cè)試使用的培養(yǎng)基不會(huì)對(duì)測(cè)試結(jié)果照成偏差的情況下，測(cè)試結(jié)果如下圖表2，3，4中所示：

隔離器表面取樣發(fā)現(xiàn)的生物負(fù)載與孔的大小成正比。

1毫米孔手套的生物負(fù)荷較低，平均值為11 CFU/cm2，初始生物量108 。

當(dāng)關(guān)注于1mm孔徑的手套后，通過(guò)雙筒放大鏡發(fā)現(xiàn)，孔的范圍為0.53mm至1 mm（表4）。在0.65mm以下，微生物負(fù)荷非常低。

結(jié)論：在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，在大約0.6 mm的孔大小下，有缺陷的手套被微生物風(fēng)險(xiǎn)的可能性較低。超過(guò)這個(gè)尺寸，微生物污染似乎會(huì)增加。 值得注意的是，在500 Pa的壓力增壓之前，研究中使用的生物負(fù)載霧化法大約有108個(gè)孢子。眾所周知，根據(jù)制藥行業(yè)的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，這種生物負(fù)載從未出現(xiàn)在生產(chǎn)環(huán)境中。因此，微生物通過(guò)的概率幾乎為零。

結(jié)合如上兩份研究資料可見，在采用脈沖增壓對(duì)手套進(jìn)行測(cè)試，如果手套儀可以檢測(cè)出0.6mm (600um) 以下的孔隙，可以對(duì)手套測(cè)試儀的運(yùn)行參數(shù)和確認(rèn)方法做一個(gè)參考依據(jù)。

但是因?yàn)榭紫对趬毫Φ淖饔孟驴赡軙?huì)發(fā)生閉合導(dǎo)致不能被手套測(cè)試儀檢測(cè)出來(lái)，所以對(duì)手套的目視檢查不能被設(shè)備檢查所替代。

參考文件：

1.Microbiological study on the management of holes in gloves for isolators. By Members of the Working Group : Barrier Technology, Marc Besson – AXYS NETWORK, Patrick Coppens – ISO’TECXEL, Edith Filaire – GROUPE ICARE, Eric Gohier – JCE BIOTECHNOLOGY, Christian Poinsot – GROUPE ICARE, Vincent Rochette – GROUPE ICARE, Antoine Toussaint – GSK VACCINES, Julien Triquet – GSK VACCINES

2.Safe Access using Glove Ports-Facts and Fiction – Johannes Rauschnabel, Albrecht Kuhnle and Kuno Lemke