中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

熱原檢測(cè)方法的發(fā)展歷史

早在1942~1943年，家兔熱原測(cè)試法就已經(jīng)被建立；1956年發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性疾病容易引起鱟血淋巴凝固，1968年發(fā)現(xiàn)脂多糖能夠?qū)е瞒c血淋巴凝固，1971年，正式建立了細(xì)菌內(nèi)毒素（鱟試劑）測(cè)試方法，1987年FDA發(fā)布了關(guān)于LAL測(cè)試指南；1995年開(kāi)啟了體外熱原測(cè)試研究， 2010年，單核細(xì)胞激活測(cè)試法(MAT)被收錄歐洲藥典。以下是熱原檢測(cè)的方法的時(shí)間圖。

圖1熱原檢測(cè)方法歷史進(jìn)程表[1]

傳統(tǒng)方法

家兔熱原測(cè)試（RPT）

家兔熱原測(cè)試是最早的檢測(cè)方法，通常來(lái)講，家兔熱原檢測(cè)被視為熱原檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。在1942年推出了這一經(jīng)典體內(nèi)測(cè)試法，在該實(shí)驗(yàn)中兔子首先被放置并固定在狹窄的盒子里，讓它們適應(yīng)環(huán)境，然后將測(cè)試物質(zhì)注射到至少三只兔子的上耳靜脈中，檢測(cè)兔子的體溫，體溫升高證明測(cè)試物質(zhì)中存在熱原。家兔熱原檢測(cè)法雖然可以檢測(cè)所有的熱原，但是它存在幾個(gè)缺點(diǎn)：①動(dòng)物的飼養(yǎng)條件可能會(huì)影響結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)果檢測(cè)不準(zhǔn)確；②由于物種特異性的差異，不同種類(lèi)兔子對(duì)熱原敏感程度也不同，這也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果存在一定的差異；③某些皮下注射的藥物（比如脂質(zhì)體），某些蛋白質(zhì)溶液（或血液制品）不太適用家兔熱原檢測(cè)，因?yàn)樗鼈儠?huì)引起過(guò)敏反應(yīng)；④動(dòng)物試驗(yàn)未經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，兔子熱原測(cè)試不能代表人類(lèi)；⑤需要使用較多兔子，操作復(fù)雜、試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)。優(yōu)點(diǎn)：不僅可以檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素，還可以檢測(cè)樣品中未表征的熱原。據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道，中藥、藥包材和其他熱原的檢測(cè)以RPT法為主，分別在各自類(lèi)別中占比66.7%、100%、78.1%。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法（鱟試劑）（LAL）

與RPT相比，LAL測(cè)試更加靈敏，1956年發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌會(huì)導(dǎo)致鱟血（血淋巴）凝固，進(jìn)而演變成LAL測(cè)試。LAL測(cè)試法其原理為細(xì)菌內(nèi)毒素分子能夠激活鱟試劑中的鱟血細(xì)胞溶解物以致發(fā)生一系列的凝集酶反應(yīng)，從而形成人肉眼可見(jiàn)的凝膠狀物質(zhì)；LAL測(cè)試法的優(yōu)點(diǎn)：對(duì)革蘭氏陰性菌脂多糖靈敏，其靈敏度可以達(dá)到0.005EU/ml；然而，該方法也存在缺點(diǎn)：①其他物質(zhì)（除了藥物）也會(huì)導(dǎo)致鱟血液凝固，比如二價(jià)陽(yáng)離子鹽、螯合物、酸、抗生素和蛋白質(zhì)等，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，抗生素（比如四環(huán)素、氨基糖苷、大環(huán)內(nèi)酯、克林霉素等）、白蛋白、β-葡聚糖（該物質(zhì)激發(fā)鱟血凝固原理如下圖）均會(huì)干擾測(cè)試結(jié)果；②鱟試劑在采血過(guò)程中，會(huì)對(duì)鱟動(dòng)物有一定的影響，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)鱟進(jìn)行采血會(huì)導(dǎo)致鱟死亡，其死亡率可以達(dá)到10~30%；③僅對(duì)革蘭氏陰性菌敏感。

由于鱟試劑的緊缺，后來(lái)發(fā)展了重組因子C測(cè)試法，該方法是通過(guò)細(xì)菌內(nèi)毒素與重組因子C結(jié)合，通過(guò)熒光信號(hào)來(lái)定量產(chǎn)品中的內(nèi)毒素，該方法的靈敏度可以達(dá)到0.005EU/ml，但也僅能鑒別出革蘭氏陰性菌的細(xì)菌內(nèi)毒素，與LAL相比，該方法沒(méi)有使用鱟試劑，可解決鱟試劑缺乏的問(wèn)題。目前LAL和重組因子C均已列入2020版《中國(guó)藥典》細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則中。

圖2 內(nèi)毒素介導(dǎo)的具有交替葡聚糖激活途徑的LAL凝血級(jí)聯(lián)激活[1]

單核細(xì)胞激活測(cè)試（MAT）

其原理為內(nèi)毒素接觸人全血的免疫細(xì)胞（單核細(xì)胞）可以釋放細(xì)胞因子蛋白，如白細(xì)胞介素-1-β（IL-1-β），從而引發(fā)機(jī)體發(fā)熱，據(jù)此建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定全血樣品中IL-1-β與內(nèi)毒素的含量。簡(jiǎn)言之，即將人血直接暴露于試驗(yàn)材料表面，通過(guò)量化促炎細(xì)胞因子進(jìn)行熱原的測(cè)定。該方法的優(yōu)點(diǎn)：①不需要使用動(dòng)物，沒(méi)有物種差異；②可以利用家兔熱原無(wú)法測(cè)試的產(chǎn)品；③MAT法常用于測(cè)定較難處理的基質(zhì)樣品，與RPT法具有較高的相關(guān)性，其檢出限低于0.1 EU/mL；缺點(diǎn)：成本更高，時(shí)間要求更高，接受程度更低，雖然已進(jìn)入歐洲藥典，但中國(guó)藥典未被納入；近10 年來(lái)研究人員對(duì)細(xì)胞法又做了許多的改進(jìn)與探索工作，按細(xì)胞的來(lái)源不同可將單核細(xì)胞法分為3大類(lèi)，包括全血法、單核細(xì)胞系法與人外周血單個(gè)核細(xì)胞( human peripheral blood monocytic cells，PBMC)，Nair等[2]將全血中分離得到的淋巴細(xì)胞進(jìn)行凍存，以IL-1β 為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)該方法用于檢測(cè)熱原(包括LPS和LTA)的可行性進(jìn)行研究，結(jié)果表明該方法可用于替代熱原檢測(cè)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法。賀慶[9]等研究發(fā)現(xiàn)PBMC-IL-6 法可檢測(cè)多種熱原，如革蘭陰性菌來(lái)源的LPS、革蘭陽(yáng)性菌來(lái)源的LTA和真菌來(lái)源的酵母多糖等，其對(duì)上述熱原的反應(yīng)總體較家兔法靈敏。對(duì)該方法的驗(yàn)證結(jié)果為:實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性為92%，實(shí)驗(yàn)室間重現(xiàn)性為86%，方法靈敏度(即真陽(yáng)性率)為 90.1% ，特異度( 即真陰性率)為92.3%，與國(guó)際同類(lèi)方法相當(dāng)。結(jié)果表明，PBMC-IL-6法具有對(duì)熱原的檢測(cè)譜寬、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、可靠性強(qiáng)等特點(diǎn)。作為現(xiàn)有熱原檢測(cè)方法的補(bǔ)充，該方法應(yīng)得到進(jìn)一步應(yīng)用。

圖3MAT方法概述[3]

圖4單核細(xì)胞測(cè)試法相對(duì)于其他檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)[4]

熱原檢測(cè)的新方法

轉(zhuǎn)基因細(xì)胞

2024年中國(guó)食品藥品檢定研究院Qing He[5]發(fā)表了一篇關(guān)于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的熱原檢測(cè)新方法，該方法是利用NF-κB（一種介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的中樞信號(hào)分子）作為致熱原標(biāo)記物，通過(guò)使用轉(zhuǎn)染了受NF-κB調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因的單核細(xì)胞系THP-1作為體外模型，通過(guò)測(cè)量熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)熱原；通過(guò)研究表明，該方法可以定量和靈敏地檢測(cè)內(nèi)毒素（來(lái)自不同菌株的脂多糖）和非內(nèi)毒素?zé)嵩?，?9代細(xì)胞中，NF-κB活性和細(xì)胞表型穩(wěn)定性良好，可用于生物制品中熱原的檢測(cè)。通過(guò)該方法檢測(cè)巴利昔單抗、腦炎疫苗等，結(jié)果顯示，三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性分別為85%、80%和80%，實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性分別為83.3%、95.6%和86.7%，試驗(yàn)的敏感性（真陽(yáng)性率）和特異性（真陰性率）可以達(dá)到為89.9%和90.9%。

去除熱原的方法

在GMP體系中，通常認(rèn)為，熱原就是細(xì)菌內(nèi)毒素，目前常用的去除內(nèi)毒素的方法主要包括超濾法、活性炭吸附法、化學(xué)降解法、相分離法、陰離子交換色譜法、親和色譜法、膜吸附法、離子放電色譜法等。其中活性炭吸附法國(guó)家不建議采用，化學(xué)降解法通常是采用高濃度酸高濃度堿進(jìn)行破壞，該種手段較為激烈，破壞內(nèi)毒素的同時(shí)，很有可能會(huì)將活性藥物破壞。下面匯總分析各種去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法及優(yōu)缺點(diǎn)。

圖5 內(nèi)毒素去除方法

根據(jù)上述表格我們可以知道，細(xì)菌內(nèi)毒素每種方法都有不同程度的優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)于不同化合物需要根據(jù)情況進(jìn)行篩選。

對(duì)于化學(xué)藥物注射劑（小分子藥物）

對(duì)于化學(xué)藥物注射劑生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，去除內(nèi)毒素的方法更多的是通過(guò)原輔包控制以及生產(chǎn)過(guò)程控制，其中比較可行簡(jiǎn)單的方法如超濾法、膜吸附法、酸堿處理以及干熱滅菌法；

干熱主要適用于玻璃包材、生產(chǎn)管道、生產(chǎn)設(shè)備等；通常情況，玻璃類(lèi)內(nèi)包材除熱原主要分為兩個(gè)步驟，第一步是對(duì)生產(chǎn)設(shè)備或包材進(jìn)行清洗并用注射用水進(jìn)行淋?chē)?；第二個(gè)步是采用250℃干熱處理至少30min；而對(duì)于膠塞類(lèi)、軟管、密封圈等，主要是通過(guò)注射用水沖洗或者漂洗，然后在進(jìn)行121℃滅菌處理。

超濾法比較適用于小分子化學(xué)藥物，特別是分子量與內(nèi)毒素分子量差別較大的化學(xué)藥，在制劑生產(chǎn)過(guò)程中可以在原輔料生產(chǎn)工序或原輔料配制工序中添加，也可以在制劑端加入。de Mas, Kientzler, &Kleindiens等[6]人利用超濾將小分子藥物BMS-753493（分子量1.57kDa）與細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行分離，通過(guò)使用3 kDa和10 kDa 兩種膜尺寸去除BMS-753493 中的內(nèi)毒素，結(jié)果顯示，兩種膜尺寸均可有效將內(nèi)毒素濃度降低至<0.03 EU/ml，但與3 kDa相比，10 kDa膜的藥物產(chǎn)量較高，約為95%，而3 kDa膜的損失約為55% BMS -753493。該超濾方法最適合從水、鹽和對(duì)內(nèi)毒素沒(méi)有親和力的小分子藥物。目前市面上更多的是采用切向流超濾，超濾法也是唯一通過(guò)美國(guó)FDA認(rèn)證的除熱原方法。

對(duì)于大分子藥物

對(duì)于大分子藥物，比如蛋白類(lèi)，納米顆粒等分子量較大藥物，超濾法可能不大適用，也許親和色譜法、相分離法、陰離子交換色譜法、膜吸附法更加可行。在以前，膜吸附法并未被廣泛使用，主要是因?yàn)槟の椒ǖ娜コ齼?nèi)毒素效率較弱；最近，研究發(fā)現(xiàn)，在過(guò)濾膜上結(jié)合吸附劑，能夠大大提高內(nèi)毒素的去除效率，根據(jù)文獻(xiàn)[7]研究報(bào)道，將兩親性炭質(zhì)顆粒嵌入PVDF濾膜上，成功去除牛血清白蛋白溶液，結(jié)果顯示，細(xì)菌內(nèi)毒素去除效率能夠大于99.8%，蛋白質(zhì)回收率大于90%。

總結(jié)：

從熱原檢測(cè)手段來(lái)看，目前主要是采用家兔熱原檢測(cè)和細(xì)菌內(nèi)毒素（鱟試劑）LAL方法，這兩種方法相對(duì)來(lái)說(shuō)比較傳統(tǒng)。與家兔熱原檢測(cè)法相比，MAT法更加方便，體外即可檢測(cè)，值得被廣泛的推廣，也許未來(lái)會(huì)取代家兔熱原檢測(cè)法。與細(xì)菌內(nèi)毒素LAL法相比，重組因子C現(xiàn)已進(jìn)入中國(guó)藥典指導(dǎo)原則，雖然暫未列入法定標(biāo)準(zhǔn)，但隨著時(shí)代的發(fā)展，鱟試劑的緊缺，重組因子C很有可能會(huì)替代LAL法。至于熱原檢測(cè)的新方法-轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，目前尚處于實(shí)驗(yàn)階段，還需更多實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

從去除熱原方法看，我們需要根據(jù)具體情況而定，對(duì)于小分子藥物，更多采用原輔料控制，生產(chǎn)過(guò)程控制，對(duì)于實(shí)在無(wú)法購(gòu)買(mǎi)符合熱原要求的原輔料，也許超濾法是目前相對(duì)成熟以及接受程度較高的方法。

對(duì)于大分子藥物，比如蛋白類(lèi)藥物，采取過(guò)程控制的同時(shí)，可以根據(jù)具體工藝選擇合適的方式進(jìn)行熱原去除，隨著未來(lái)的發(fā)展，膜吸附法可能是一個(gè)比較有前景的方法，因?yàn)樗哂蟹奖?、?jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但該方法還在發(fā)展中，相信不久將來(lái)，膜吸附法能夠被廣泛使用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Fennrich S, Hennig U, Toliashvili L, 等. More than 70 Years of Pyrogen Detection: Current State and Future Perspectives[J]. Alternatives to Laboratory Animals, 2016, 44(3): 239–253.

[2]Nair S R, Geetha C S, Mohanan P V. Analysis of IL-1  β Release from Cryopreserved Pooled Lymphocytes in Response to Lipopolysaccharide and Lipoteichoic Acid[J]. BioMed Research International, 2013, 2013: 1–10.

[3]Endotoxin Detection and Control in Pharma, Limulus, and Mammalian Systems[M]. K.L. Williams. Cham: Springer International Publishing, 2019.

[4]Hartung T. Pyrogen testing revisited on occasion of the 25th anniversary of the whole blood monocyte activation test[J]. ALTEX, 2021: 3–19.

[5]He Q, Yu C-F, Wu G, 等. A novel alternative for pyrogen detection based on a transgenic cell line[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2024, 9(1): 33.

[6]De Mas N, Kientzler D C, Kleindienst D. Endotoxin Removal from a Small-Molecule Aqueous Drug Substance Using Ultrafiltration: A Case Study[J]. Organic Process Research & Development, 2015, 19(9): 1293–1298.

[7]Wu Q, Xu Y, Yang K, 等. Fabrication of membrane absorbers based on amphiphilic carbonaceous derivatives for selective endotoxin clearance[J]. J. Mater. Chem. B, 2017, 5(41): 8219–8227.

[8]林麗花熱原檢測(cè)結(jié)果淺析[J]  海峽藥學(xué) 2020 年第32 卷第8 期

[9] 賀慶，高華，譚德講等．人外周血單個(gè)核細(xì)胞熱原檢測(cè)法的研究［J］．藥物分析雜志，2012，32( 10) : 5－11