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反相有關(guān)物質(zhì)方法開(kāi)發(fā)時(shí)，一般是基于建立一套方法對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制的原則，本文主要針對(duì)具有一定疏水性和極性化合物進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)方法開(kāi)發(fā)，故強(qiáng)極性化合物有關(guān)物質(zhì)方法開(kāi)發(fā)不在本文討論范圍內(nèi)。

創(chuàng)新藥研發(fā)周期長(zhǎng)，涉及多個(gè)化合物（起始物料、中間體和成品等）有關(guān)物質(zhì)方法開(kāi)發(fā)，且創(chuàng)新藥的工藝路線隨著研發(fā)進(jìn)程處于持續(xù)優(yōu)化狀態(tài)，因此需要不斷更新雜質(zhì)控制方法，有關(guān)物質(zhì)方法開(kāi)發(fā)任務(wù)量可見(jiàn)一斑，而創(chuàng)新藥幾乎很難查詢(xún)到可供參考的色譜方法信息。為了在有限的時(shí)間內(nèi)保質(zhì)保量完成方法開(kāi)發(fā)工作，起到快速助力原料藥工藝路線開(kāi)發(fā)與優(yōu)化的目的，進(jìn)一步優(yōu)化人員和資源的分配，提高方法開(kāi)發(fā)效率和整體質(zhì)量研究水平，建立一套通用的方法開(kāi)發(fā)流程至關(guān)重要。

研發(fā)初期因質(zhì)量研究人員所能獲知的化合物信息有限，雜質(zhì)結(jié)構(gòu)信息（一般工藝路線處于保密狀態(tài)）未知；而在研發(fā)中后期才有可能獲取該信息，故本文將有關(guān)物質(zhì)方法開(kāi)發(fā)流程分為這兩部分分別進(jìn)行闡述。

化合物水溶性較差時(shí)首選C18色譜柱，化合物水溶性較大時(shí)（如疏水性較大的氨基酸類(lèi)）首選極性嵌入色譜柱，色譜柱孔徑一般選擇80A-130A（分子量<2000時(shí)）。

A-E類(lèi)均為耐寬pH范圍的C18色譜柱，其中A類(lèi)為中等疏水性C18色譜柱；B類(lèi)與A類(lèi)不相似，疏水性存在差異(根據(jù)Eureby色譜柱性能評(píng)估參數(shù)：CDF>1或根據(jù)PQRI Database：F>3，B類(lèi)疏水性略高于A類(lèi))；C類(lèi)色譜柱為高密度鍵合C18官能團(tuán)，適用于疏水異構(gòu)體或類(lèi)似物分離；D類(lèi)固定相帶正電荷，可以改善堿性化合物峰形（若要兼顧分離和峰形，也可考慮使用普通色譜柱，在流動(dòng)相中加入離子對(duì)/離液劑），增加酸性化合物保留；E類(lèi)為核殼柱或表面多孔柱，可提高化合物柱效和靈敏度。

F、G與H類(lèi)為極性嵌入色譜柱（可兼容100%水相），在中、低pH流動(dòng)相條件下這三類(lèi)色譜柱對(duì)極性和疏水性化合物的選擇性存在差異（疏水性順序：G>F>H，故G類(lèi)可以兼顧疏水和極性跨度較大的化合物，F(xiàn)和H適合疏水性不高或具有一定立體選擇性的化合物，如環(huán)肽藥物；立體選擇順序：F>H；F與H固定相均鍵合酰胺基團(tuán)，具有氫鍵作用：H>F）；F類(lèi)適用于堿性極性化合物保留和峰形改善，pH耐受范圍2-11；G和H類(lèi)pH耐受范圍2-8；極性嵌入色譜柱可搭配含離液試劑的流動(dòng)相以增強(qiáng)極性化合物保留，同時(shí)避免疏水化合物過(guò)度保留。

圖1注釋?zhuān)?/span>

1. 為了提高在方法開(kāi)發(fā)時(shí)色譜柱的篩選效率，建議適時(shí)歸類(lèi)整理耐寬pH范圍的可及性色譜柱，即使篩選時(shí)暫時(shí)無(wú)法獲得此類(lèi)色譜柱，也可選擇其他相似色譜柱(F<3或CDF<1，可通過(guò)以下兩個(gè)網(wǎng)址進(jìn)行查詢(xún)：https://apps.usp.org/app/USPNF/columnsDB.html和https://www.acdlabs.com/resources/free-chemistry-software-apps/column-selector/)。

2. 首選耐寬pH范圍的色譜柱，可以避免流動(dòng)相pH更換時(shí)色譜柱不耐受低pH和高pH的情況，同時(shí)可有效節(jié)省更換色譜柱帶來(lái)的沖柱和過(guò)渡時(shí)間，進(jìn)一步提高流動(dòng)相篩選效率。

3. 流動(dòng)相pH選擇在化合物信息未知的情況下建議從低pH依次篩選至高pH條件（通過(guò)分離度和峰形等綜合評(píng)估流動(dòng)相適宜的pH），同時(shí)需兼顧化合物在酸性或堿性條件下的穩(wěn)定性（溶液穩(wěn)定性考察可初步判斷）和化合物酸堿性：在低pH下時(shí)C18色譜柱固定相的離子作用最弱，當(dāng)待分析物為堿性化合物時(shí)，由離子作用造成的峰形差的可能性會(huì)大大降低；當(dāng)待分析物為酸性化合物時(shí)，化合物以電中性形式存在也可提高疏水性，有助于分離；流動(dòng)相選擇其他pH主要基于化合物帶電性能即pKa，如當(dāng)以離子化形式存在的化合物間不能有效分離時(shí)，可通過(guò)改變流動(dòng)相pH使離子化分析物呈電中性，提高疏水性進(jìn)而改善分離。

4. 在化合物檢測(cè)波長(zhǎng)信息未知前提下，有機(jī)相首選乙腈主要基于該溶劑紫外截止波長(zhǎng)在200nm以下，水相用于調(diào)節(jié)pH的添加劑或緩沖鹽建議選擇紫外截止波長(zhǎng)較低的試劑/試藥（若待分析物間的分離對(duì)流動(dòng)相pH不敏感時(shí)，流動(dòng)相pH是否處于緩沖鹽緩沖范圍內(nèi)不是必需：如當(dāng)流動(dòng)相pH為4.5時(shí)，緩沖鹽為磷酸鹽也是可行的，此時(shí)磷酸鹽的作用主要是為了改善峰形）；當(dāng)分離存在風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，需篩選有機(jī)相體系，如甲醇或乙腈+甲醇體系。

如何從成百上千根色譜柱中篩選出適合不同化合物分析的色譜柱，本文給出了一定參考。按照上述有關(guān)物質(zhì)反相方法開(kāi)發(fā)流程，可以提升研發(fā)人員的色譜柱篩選能力（特別適合新手小白），不僅提高了方法開(kāi)發(fā)效率，降低成本的同時(shí)，還提升了整個(gè)團(tuán)隊(duì)的研發(fā)水平。