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背景

治療性單克隆抗體(mAb)在治療腫瘤藥物中起到非常關(guān)鍵的作用，目前已經(jīng)批準(zhǔn)上市的單克隆抗體藥物大約200種，其中治療腫瘤相關(guān)疾病的大約90種。單克隆抗體作為免疫治療癌癥的方法已在各種癌癥類型的治療中得到驗(yàn)證，并取得良好的效果，多款以PD-1等免疫檢查點(diǎn)作為靶點(diǎn)上市的抗體藥物成為了mAb治療癌癥的代表[1]。

在這些藥物的研發(fā)過程中，受體占有率（Receptor Occupancy，RO）可以反映抗體等蛋白類藥物與細(xì)胞表面靶點(diǎn)的相對(duì)結(jié)合程度，受體占有率生物分析是抗體等大分子藥物臨床開發(fā)中重要的藥效學(xué)（PD）指標(biāo)之一[2]。RO生物分析有助于建立生物治療劑的最小生物效應(yīng)水平，并建立最佳的給藥方案[3]，也可以幫助更好理解藥代動(dòng)力學(xué)-藥效學(xué)（PK-PD）的關(guān)系[4]。此外，RO分析生成的數(shù)據(jù)可用于評(píng)估安全性，例如，長(zhǎng)期最大RO可能是過量給藥的標(biāo)志，與靶點(diǎn)長(zhǎng)期結(jié)合，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用甚至毒性[5-6]。近年來，包括PD-1/PD-L1,Tim-3,LAG-3,4-1BB,CD3和CD47等眾多靶點(diǎn)的單抗藥物在臨床的研究中，RO的生物分析都起到了非常重要的作用。

什么是受體占有率

RO，即受體占有率（Receptor Occupancy），是檢測(cè)蛋白類藥物對(duì)特定細(xì)胞亞群表面的特異靶點(diǎn)占據(jù)的程度（圖1）。蛋白類藥物主要包括單克隆抗體、配體、ADC和融合蛋白等；細(xì)胞亞群一般為外周血細(xì)胞，如紅細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞亞群（T細(xì)胞/B細(xì)胞/NK/單核/粒細(xì)胞等）；藥物靶點(diǎn)主要涉及PD-1/PD-L1、Tim3、4-1BB、CCR4、CD3和CD20等。

圖1 :RO檢測(cè)示意圖，圖片引自文獻(xiàn)[7]

生物分析在藥物臨床研究中的意義

首先，劑量選擇方面，RO生物分析可輔助早期劑量設(shè)定，隨著藥物濃度的增加，可以檢測(cè)出RO飽和時(shí)所需的藥物濃度；也可以幫助評(píng)估生物制劑的最小生物效應(yīng)水平[3]，在劑量爬坡實(shí)驗(yàn)中，可以幫助評(píng)估最佳給藥劑量，其次，藥理監(jiān)測(cè)方面：RO生物分析可監(jiān)測(cè)治療藥物與靶點(diǎn)的持續(xù)結(jié)合，評(píng)估給藥間隔、頻次等；例如，隨著時(shí)間推移，RO在飽和后，又會(huì)逐漸的降低，藥效也可能會(huì)降低，此時(shí)，再次給藥，RO將再次達(dá)到飽和；同時(shí)，RO生物分析也可以作為生物標(biāo)志物評(píng)估PK/PD的關(guān)系[4]；然后，安全評(píng)估方面RO生物分析可評(píng)估靶點(diǎn)可能存在的安全風(fēng)險(xiǎn)，如CD47單抗的靶點(diǎn)位于腫瘤細(xì)胞，但紅細(xì)胞也表達(dá)該靶點(diǎn)，紅細(xì)胞上RO增加將會(huì)導(dǎo)致的紅細(xì)胞裂解，進(jìn)而引起貧血，這種情況下，紅細(xì)胞的RO生物分析就顯得十分重要；最后，RO生物分析可以評(píng)估長(zhǎng)期飽和RO所導(dǎo)致毒副作用以及靶點(diǎn)非特異結(jié)合所產(chǎn)生的毒性[5-6]。

受體占有率的生物分析策略

平臺(tái)的選擇：流式細(xì)胞平臺(tái)是臨床前和臨床試驗(yàn)中生物標(biāo)志物分析和藥物開發(fā)強(qiáng)有力的工具，因?yàn)樗軌蛟趩渭?xì)胞水平上檢測(cè)多種異質(zhì)細(xì)胞群以及其表達(dá)的靶點(diǎn)，故可以檢測(cè)靶點(diǎn)在感興趣的細(xì)胞群體上與藥物的結(jié)合，評(píng)估靶點(diǎn)與藥物結(jié)合的程度。

策略選擇：RO生物分析的基本策略包括兩大類：直接法和間接法，這是RO分析兩種最基本的形式，在實(shí)際應(yīng)用中兩種方式會(huì)有多種變化形式。直接法：臨床給藥后，需同時(shí)測(cè)出占據(jù)靶點(diǎn)位點(diǎn)的數(shù)量（圖2-B）和藥物飽和時(shí)位點(diǎn)的數(shù)量，其中飽和位點(diǎn)的檢測(cè)需要在樣本中加入過量藥物，這樣可以使所有的靶點(diǎn)均被占據(jù)?；居?jì)算公式如下：RO的計(jì)算是受體占有率%=結(jié)合受體量/總受體量×100%；直接法中，檢測(cè)試劑（檢測(cè)抗體）的篩選非常重要。檢測(cè)試劑的選擇可以有多種，根據(jù)不同的藥物，選擇通用型抗人IgG的抗體，抗IgG亞型抗體或抗藥抗體。

間接法：使用和藥物非競(jìng)爭(zhēng)性的抗體測(cè)出靶點(diǎn)的總量（圖2-C），使用和藥物競(jìng)爭(zhēng)的抗體測(cè)出游離位點(diǎn)（圖2-A）也就是沒有被藥物占據(jù)的靶點(diǎn)的量，兩者相減后，除以靶點(diǎn)總量即可得出受體占有率?；竟饺缦拢菏荏w占有率%=100%-游離受體/總受體×100%。間接法的檢測(cè)試劑的選擇同樣重要，其中篩選到合適的競(jìng)爭(zhēng)性抗體是關(guān)鍵。此外也可以采用熒光標(biāo)記藥物進(jìn)行間接法受體占有率測(cè)定。

圖2：受體占有率分析的基本策略（圖2引自文獻(xiàn)[8]）

數(shù)據(jù)表現(xiàn)形式：（1）陽性百分比；(2)平均熒光強(qiáng)度或者等量可溶性熒光分子量（molecules of equivalent soluble fluorochrome ，MESF）。

RO分析的基本策略的設(shè)計(jì)考量點(diǎn)

首先需要考慮的就是藥物背景及臨床方案，抗體的IgG亞型會(huì)影響試劑的選擇，而抗體的結(jié)構(gòu)是單抗還是雙抗或者多功能抗體也會(huì)影響基本策略的選擇和結(jié)果計(jì)算及分析；臨床方案中是否聯(lián)合用藥，聯(lián)合用藥是否感染干擾目標(biāo)受體的檢測(cè)；還要考慮藥物是否會(huì)產(chǎn)生明顯的免疫原性，ADA或者Nab也會(huì)影響受體的檢測(cè) ；如果臨床考察RO的目的除了藥效還有安全性的考慮，則RO生物分析可能還要涉及安全性相關(guān)的細(xì)胞群（比如：紅細(xì)胞）。與此同時(shí)，了解靶點(diǎn)（受體）在哪些細(xì)胞群表達(dá)以及在細(xì)胞群的表達(dá)豐度會(huì)幫助科學(xué)篩選目標(biāo)細(xì)胞群和準(zhǔn)確的計(jì)算RO。最后，樣本的類型（外周血\PBMC\腫瘤等）、儲(chǔ)存條件和處理方法等也需要考慮進(jìn)去。

受體占位生物分析挑戰(zhàn)

由于藥物結(jié)構(gòu)復(fù)雜和靶點(diǎn)多樣化以及表達(dá)差異等原因，RO生物分析方法的建立具有相當(dāng)?shù)奶魬?zhàn)，本文主要討論在臨床樣本進(jìn)行RO分析時(shí)主要有以下幾個(gè)挑戰(zhàn)：（1）樣品穩(wěn)定性：臨床采集全血樣本或者組織樣本均涉及新鮮活細(xì)胞，從研究場(chǎng)所采集運(yùn)輸?shù)綑z測(cè)實(shí)驗(yàn)室，通常需要相當(dāng)?shù)臅r(shí)間，如果樣品穩(wěn)定性控制不好，從樣品采集到分析的時(shí)間即可能會(huì)影響實(shí)際RO水平。針對(duì)不同的靶點(diǎn)可以使用不同類型抗凝劑或市售的穩(wěn)定試劑，可以優(yōu)化和延長(zhǎng)樣品穩(wěn)定性。如果穩(wěn)定期太短，可能要在采集后進(jìn)行固定和染色。（2）臨床樣本量不足：由于單次檢測(cè)RO通常至少需要100μl左右全血，再加上復(fù)管和對(duì)照管，可能需要更多體積的全血，而臨床采集的全血樣本通常有多個(gè)檢測(cè)目的，此時(shí)可以考慮使用多重檢測(cè)的方式，同時(shí)檢測(cè)免疫表型和相關(guān)靶點(diǎn)RO，這樣可以節(jié)約全血的體積，同時(shí)也對(duì)人員和儀器都有更高的要求。（3）靶點(diǎn)在靶細(xì)胞上表達(dá)量低：例如Tim3，在靶細(xì)胞上表達(dá)很低，對(duì)方法驗(yàn)證的完成造成了挑戰(zhàn)，此時(shí)需要跟據(jù)不同的靶點(diǎn)選擇不同的刺激劑，來增加靶點(diǎn)的表達(dá)。選擇可替代的表達(dá)靶點(diǎn)較高的細(xì)胞群也是可以選擇的方案。（4）生物變異性：在RO分析策略設(shè)計(jì)之前，要充分考慮到檢測(cè)靶點(diǎn)的測(cè)量范圍，用于方法驗(yàn)證的樣品的分析物的檢測(cè)值應(yīng)該覆蓋預(yù)期的樣本中分析物的檢測(cè)范圍。（5）免疫原性：樣本中含有ADA可能會(huì)影響RO的檢測(cè)。（6）關(guān)鍵檢測(cè)試劑：篩選完全競(jìng)爭(zhēng)或者特異性良好的抗體也是方法開發(fā)和驗(yàn)證中重要的環(huán)節(jié)。

結(jié)語

開發(fā)和驗(yàn)證準(zhǔn)確及穩(wěn)定的受體占有率生物分析方法在藥效動(dòng)力學(xué)等方面起到非常重要的作用，然而，由于抗體藥物本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜且靶點(diǎn)多樣化，在開發(fā)和驗(yàn)證其生物分析方法中充滿了挑戰(zhàn)。流式細(xì)胞平臺(tái)（FACS）具有強(qiáng)大的檢測(cè)異質(zhì)細(xì)胞群和與靶點(diǎn)與細(xì)胞結(jié)合的能力，通常RO分析會(huì)選擇該平臺(tái)。對(duì)于藥物結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)以及靶點(diǎn)的生物學(xué)背景的深刻理解是方法成功開發(fā)的前提，基本策略的選擇、關(guān)鍵試劑篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證等方面均是方法開發(fā)的基本環(huán)節(jié)。目前藥明康德測(cè)試事業(yè)部臨床生物分析團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開發(fā)并驗(yàn)證了多種符合GLP法規(guī)要求的RO生物分析方法，藥物蛋白的種類包含單抗、雙抗和多功能抗體，所涉及的靶點(diǎn)包括PD-1、PD-L1、Tim-3、LAG-3、4-1BB、CD3和CD85d等。在FACS平臺(tái)積累了豐富的RO生物分析經(jīng)驗(yàn)，可以幫客戶解決抗體等大分子藥物再臨床生物分析中遇到的各種挑戰(zhàn)，加速藥物研發(fā)和上市的進(jìn)度。

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