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在從大體積材料轉(zhuǎn)向多孔材料時(shí)，在可生物降解材料中調(diào)和快速降解和過量毒性之間的兩難境地具有挑戰(zhàn)性。在骨科領(lǐng)域，鋅生物可降解材料具有優(yōu)異的力學(xué)性能、成骨和抗菌生物活性，被廣泛研究應(yīng)用于螺釘和鋼板系統(tǒng)、髓內(nèi)針、骨移植、引導(dǎo)骨再生膜等。近日，北京航空航天大學(xué)楊宏韜、王曉剛、清華大學(xué)溫鵬、北京大學(xué)鄭玉峰通過骨免疫成化實(shí)現(xiàn)了顯著的骨向內(nèi)生長到具有 90% 孔隙率的Zn多孔支架中。在微尺度上，采用一種含0.8 wt% Li的合金，形成具有LiZn4和Zn相的共晶狀層狀結(jié)構(gòu)。這種微結(jié)構(gòu)平衡了高強(qiáng)度和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。在中尺度上，具有納米級(jí)粗糙度的表面模式促進(jìn)絲狀偽足形成和巨噬細(xì)胞擴(kuò)散。在宏觀尺度上，各向異性最小表面G單位比各向異性體心立方單位具有適當(dāng)?shù)木鶆蛐越到饴?。在體內(nèi)，G支架在促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抗炎表型極化方面表現(xiàn)出更高效率，隨后導(dǎo)致成骨標(biāo)志物顯著升高，膠原沉積增加，新骨形成增強(qiáng)。在體外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，巨噬細(xì)胞中JAK/STAT通路的表達(dá)通過上調(diào)IL-4、IL-10的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨。

相關(guān)研究成果以“Multiscale architecture design of 3D printed biodegradable Zn-based porous scaffolds for immunomodulatory osteogenesis”為題于2024年4月11日發(fā)表在《Nature Communications》上。

圖1 用于生物降解骨支架的Zn合金組合設(shè)計(jì)

具有骨免疫調(diào)節(jié)能力的生物可降解鋅支架的優(yōu)越力學(xué)性能和適當(dāng)表面腐蝕及離子釋放行為是主要考慮因素。對(duì)于Zn-Li合金，強(qiáng)度、塑性和Li元素的加入之間存在權(quán)衡（圖1a）。由Zn和LiZn4組成的層狀微觀結(jié)構(gòu)主要出現(xiàn)在Zn-0.8Li合金中，層間距為200–300 nm（圖1B）。當(dāng)材料浸入模擬體液（SBF）中時(shí)，材料的表面阻抗隨著Li含量的增加而顯著增加（圖1C）。在SBF中浸泡24小時(shí)后，氧化鋅（ZnO）和碳酸鋰（Li2CO3）是SBF-氧化鋰合金中的主要腐蝕產(chǎn)物（圖1D）。Zn-0.2Li和Zn- 0.8Li合金的表面電位分布相似，且在SBF中是均勻的（圖1E）。在細(xì)胞培養(yǎng)基中，Li部分替代鋅的釋放（圖1F），在Zn-0.8Li合金中，Zn：Li比約為4：1。與對(duì)照組和純鋅組相比，Zn-Li合金組的CD206表達(dá)更多，iNOS表達(dá)更少（圖1G），特別是在Zn-0.8Li組中。免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-4、IL-10、Arg1的RNA表達(dá)在Zn-0.8Li合金組達(dá)到峰值，同時(shí)抑制促炎細(xì)胞因子TNF-ɑ、iNOS、IL-1β等促炎細(xì)胞因子的RNA表達(dá)（圖1H）。

圖2 Zn-0.8Li支架的表面形態(tài)及性能 

超聲處理后，支架仍覆蓋未熔化的粉末和致密的氧化層（圖2A）。AFM圖像顯示酸蝕刻表面有序的突起，Ra約為79nm（圖2B）。將RAW264.7細(xì)胞接種在支架上，觀察細(xì)胞與表面模式之間的相互作用(圖2C）。Nyquist和bode圖顯示，與打印表面相比，酸蝕刻以較小的阻抗激活支架表面，而EC拋光在一定程度上使表面重新鈍化（圖2D）。

圖3 具有體心立方（BCC）和G孔單元的Zn-Li多孔支架的機(jī)械性能和腐蝕性能

圖3A顯示了具有BCC和G孔單元的Zn-Li多孔支架的單軸壓縮行為。通過電化學(xué)試驗(yàn)了解孔隙單元對(duì)Zn-Li支架早期腐蝕行為的影響（圖3B）。然后將樣品浸入模擬體液動(dòng)態(tài)灌注的專用室中28天，以了解孔隙單元對(duì)Zn-Li多孔支架長期腐蝕行為的影響（圖3C）。使用G單元的支架中腐蝕產(chǎn)物較少，且大部分金屬支柱在28天內(nèi)保持完整。

圖4 具有BCC和G孔單元的Zn-Li多孔支架的RAW264.7和MC3T3-E1細(xì)胞的體外生物相容性評(píng)估

RAW264.7和MC3T3-E1是骨缺損修復(fù)過程中的兩個(gè)主要效應(yīng)細(xì)胞。單元幾何形狀對(duì)RAW264.7和MC3T3-E1粘附和增殖的影響如圖4所示。活/死染色顯示，大部分RAW264.7和MC3T3-E1細(xì)胞在兩種支架上均存活48 h。G單元上的RAW264.7細(xì)胞具有廣泛的富含F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的絲狀偽足；MC3T3-E1緊密粘附在多孔支架表面并擴(kuò)散，細(xì)胞伸長并與周圍細(xì)胞相互作用，呈現(xiàn)出拉伸的細(xì)胞骨架。

圖5 Zn-Li多孔支架調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，誘導(dǎo)體外成骨分化

與用 BCC 支架處理的巨噬細(xì)胞相比，G支架處理的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞骨架面積比較低（圖5A），表明G支架最大限度地拉伸細(xì)胞骨架。BCC和G支架組均顯著上調(diào) CD206 表達(dá)，同時(shí)抑制 iNOS 表達(dá)（圖5B）。與對(duì)照組相比，BCC支架組和G支架組中與M1表型相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，而與M2表型相關(guān)的基因表達(dá)均上調(diào)（圖5C）。為了探討G支架誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的生物分子機(jī)制，采用轉(zhuǎn)錄組分析分析Zn組和對(duì)照組巨噬細(xì)胞的信號(hào)通路差異（圖5D）。火山圖顯示有287個(gè)上調(diào)基因和58個(gè)下調(diào)基因，表明存在廣泛的基因表達(dá)差異。為了研究巨噬細(xì)胞極化對(duì)成骨分化的影響，將MC3T3-E1細(xì)胞在含有成骨成分的條件培養(yǎng)基（CM）中培養(yǎng)。第14天對(duì)礦化基質(zhì)中鈣結(jié)合蛋白的ARS染色顯示，G支架組的鈣結(jié)節(jié)的大小和數(shù)量都高于BCC組，表明MC3T3-E1細(xì)胞的鈣沉積效率更高（圖5E、F）。采用qRT-PCR方法檢測(cè)Alp、Opg、Opn和Col1a1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，BCC組和G組的成骨相關(guān)基因表達(dá)均增加（圖5G）。

圖6 具有BCC和G孔單元的Zn-Li多孔支架在大鼠股骨中的體內(nèi)降解行為

采用X射線熒光成像光譜儀（XRF）、掃描電子顯微鏡（SEM）和顯微CT等方法，對(duì)Zn-Li多孔支架隨時(shí)間推移的2D和3D生物降解情況進(jìn)行可視化。第3天，在骨缺損區(qū)清晰可見輪廓完整的支架支柱（圖6A）。XRF檢測(cè)到分布在孔隙區(qū)域和缺損區(qū)域邊緣的Zn（藍(lán)色）信號(hào)（圖6B），表明支架的早期生物降解。在1個(gè)月時(shí)，BCC支架發(fā)生嚴(yán)重降解，部分孔隙完全充滿降解產(chǎn)物；相比之下，G支架的降解更加均勻。因此，與BBC相比，具有G的Zn-Li支架在材料的生物降解和骨再生之間具有更好的匹配性。

圖7 Zn-Li多孔支架在大鼠股骨3天和1個(gè)月時(shí)的炎癥反應(yīng)和早期成骨

圖8 3個(gè)月大鼠股骨中具有BCC和G單元的Zn-Li多孔支架的骨再生

損傷后3天，M1型巨噬細(xì)胞主要出現(xiàn)在BCC支架中，而G支架的M2/M1比值約為1：1（圖7A）。在1個(gè)月時(shí)，G支架中的M2/M1比值是BBC支架的2倍以上。同時(shí)，G支架中早期成骨因子（ALP和OCN）的表達(dá)顯著升高（圖7B）。因此，在3個(gè)月時(shí)，G支架的骨再生明顯優(yōu)于BBC支架。此外，G支架的彎曲幾何形狀可以很好地指導(dǎo)Ⅰ型膠原蛋白的分泌。大量的膠原纖維沿著G支架的支柱良好地排列和定向，這在BCC支架中是不可見的（圖8）。

小結(jié)

圖9 用于免疫調(diào)節(jié)成骨的3D打印可生物降解Zn多孔支架的多尺度集成設(shè)計(jì)

總之，本研究通過應(yīng)用于鋅多孔支架的多尺度結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，解決了利用骨內(nèi)膜調(diào)節(jié)來平衡快速降解和避免過度毒性的難題（圖9）。在合金中加入0.8 wt.% Li，為支架打印提供堅(jiān)實(shí)的機(jī)械基礎(chǔ)。從Zn-0.8Li合金中同時(shí)釋放Zn和Li離子顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞極化，有利于促再生表型。Zn-0.8Li合金交替排列的LiZn4和Zn相，層間間距為200-300nm的獨(dú)特結(jié)構(gòu)便于通過EC拋光創(chuàng)建納米級(jí)波浪狀微圖案。這反過來可以在早期附著期間激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)高擴(kuò)散區(qū)域和絲狀偽足的形成。G支架以其各向異性特征和最小的表面幾何形狀而著稱，在體內(nèi)、外都表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)慕到馑俾?。因此，G支架在1個(gè)月內(nèi)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抗炎表型極化的效率提高，導(dǎo)致成骨標(biāo)志物顯著升高，膠原沉積增加，并在3個(gè)月時(shí)增強(qiáng)新骨形成。此外，G支架可能通過上調(diào)IL-4和IL-10的表達(dá)來激活巨噬細(xì)胞中的JAK/STAT通路，進(jìn)而促進(jìn)成骨。

文章來源：https://doi.org/10.1038/s41467-024-47189-5