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摘  要 / Abstract

人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸癌的主要原因，通過(guò)接種HPV疫苗，可有效降低HPV感染的風(fēng)險(xiǎn)，繼而降低宮頸癌的患病概率。本文闡述了HPV的分型、分子流行病學(xué)研究以及國(guó)內(nèi)已上市HPV疫苗情況，介紹了本公司自主研發(fā)的重組三價(jià)HPV疫苗及其技術(shù)創(chuàng)新性，并開展了免疫原性研究。結(jié)果表明，重組三價(jià)HPV疫苗可使小鼠和大鼠產(chǎn)生高滴度、持久性強(qiáng)的特異性中和抗體，并且免疫效果與默沙東公司研制的Gardasil疫苗相當(dāng)。

Persistent human papillomavirus(HPV) infection is the main cause of cervical cancer induction. HPV vaccination effectively reduces the risk of HPV infection, thereby decreasing the probability of cervical cancer. This article describes HPV typing, molecular epidemiology, and the current market status of HPV in China. Additionally, it introduces the research and development and technological innovation of a recombinant trivalent HPV vaccine independently developed by our company.Immunogenicity research has been conducted, revealing that recombinant trivalent HPV vaccine can induce high-titer and long-lasting specific neutralizing antibodies in mice and rats. The immune effect is comparable to that of Gardasil, a vaccine developed by Merck.

關(guān) 鍵 詞 / Key words

人乳頭瘤病毒；分子流行病學(xué)；宮頸癌；疫苗；免疫原性

human papillomavirus; molecular epidemiology; cervical cancer; vaccine; immunogenicity

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是女性生殖道及皮膚黏膜常見病原體，其感染比較常見，80%以上女性一生中至少感染過(guò)1次HPV[1]。一項(xiàng)由世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer, IARC）主導(dǎo)的研究表明，世界范圍內(nèi)22個(gè)國(guó)家的1000例組織學(xué)確認(rèn)的浸潤(rùn)性宮頸癌病例的HPV檢測(cè)結(jié)果顯示，99.7%的宮頸癌呈現(xiàn)HPV-DNA陽(yáng)性，表明HPV是誘發(fā)宮頸癌的主要因素[2-4]。HPV感染宿主上皮細(xì)胞后，會(huì)使宿主基因組發(fā)生不穩(wěn)定和不可逆的改變。研究證明，高危型HPV的E6和E7分別通過(guò)降解抑癌基因p53和p Rb來(lái)誘發(fā)宮頸癌[5-6]。病原生物學(xué)、流行病學(xué)等證據(jù)充分表明，宮頸癌是由高危型HPV的持續(xù)感染引起的[7]。目前已經(jīng)確認(rèn)，HPV可以引起宮頸癌、陰莖癌、外陰癌、陰道癌、肛門癌和口咽癌（食管癌）等惡性腫瘤[8-16]。

1、HPV分型

根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV）的報(bào)告，HPV屬于乳頭瘤病毒科（Papillomaviridae）。乳頭瘤病毒科已知有至少53個(gè)屬，HPV主要分布在Alphapapilomavirus（共14個(gè)種，其中13個(gè)種含HPV）、Betapapilomavirus（共6個(gè)種，其中5個(gè)種含HPV）、Gammapapil omavirus（共27個(gè)種，均含HPV）、Mupapilomavirus（共3個(gè)種，均含HPV）和Nupapillomavirus（共1個(gè)種，含HPV）這5個(gè)屬中[7]。目前已知的HPV有200多個(gè)型別，分屬上述5個(gè)屬中的40多個(gè)種。不同型別HPV的L1基因序列差異大于10%，而同一型別HPV的序列差異小于2%[17]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)專題工作組依據(jù)HPV致癌性的不同將其分為三類，即高危型、低危型和可疑高危型[18-19]。我國(guó)HPV檢測(cè)的型別范圍依據(jù)2015年11月26日原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測(cè)及基因分型、試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》明確為：(1)高危型HPV：包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68，共13種基因型，具有確定的致癌性。高危型HPV主要屬于HPV系譜分類的α屬內(nèi)的不同種（包括Alphapapillomavirus 5、Alphapapillomavirus 6、Alphapapillomavirus 7、Alphapapillomavirus 9），其中HPV16和HPV58屬于Alphapapillomavirus 9,HPV18屬于Alphapapillomavirus 7。高危型HPV的感染與宮頸癌及癌前病變的發(fā)生密切相關(guān)，此外還與肛門癌、陰道癌、口咽癌及癌前病變的發(fā)生密切相關(guān)。(2)低危型HPV：包括HPV6和HPV11，屬于HPV α屬的Alphapapillomavirus 10，無(wú)致癌性。HPV6和HPV11的感染與90%以上的尖銳濕疣和低級(jí)別鱗狀上皮增生病變的發(fā)生密切相關(guān)。(3)可疑高危型HPV:HPV26、53、66、73和82，共5種基因型。

2、HPV的分子流行病學(xué)

宮頸癌是由高危型HPV的持續(xù)感染引起的。不同的HPV型別在世界各地的流行病學(xué)分布不同。根據(jù)人乳頭瘤病毒資訊中心（HPV Information Centre）發(fā)布的最新調(diào)查報(bào)告，在全球范圍內(nèi)，宮頸癌患者中宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，前10位的HPV感染型別為：HPV16(55.2%)、HPV18(14.2%)、HPV45(5.0%)、HPV33(4.2%)、HPV58(3.9%)、HPV31(3.5%)、HPV52(3.5%)、HPV35(1.7%)、HPV39(1.5%)、HPV59(1.4%)[20]。在中國(guó)，宮頸癌患者中宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，前10位的HPV感染型別為：HPV16(59.5%)、HPV18 (9.6%)、HPV5 =8(8.2%)、HPV52(6.5%)、HPV33(3.5%)、HPV31(2.8%)、HPV59(2.6%)、HPV45(1.9%)、HPV39(1.5%)、HPV56(1.1%)[20]。

2023年，人乳頭瘤病毒資訊中心最新的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，在全球范圍內(nèi)宮頸細(xì)胞學(xué)檢查正常的女性中，HPV感染率為29.8%。按洲統(tǒng)計(jì)，大洋洲最高，為66.7%；其次是非洲、美洲和歐洲，分別為39.2%、34.5%和27.2%，最低的是亞洲，為20.8%[20]。此外，有報(bào)告指出HPV感染主要通過(guò)性行為傳播，其感染率高低主要取決于人群的年齡和性行為習(xí)慣。年輕的性活躍女性子宮頸部位HPV感染率最高，感染高峰年齡在20歲左右。我國(guó)女性存在第二個(gè)HPV感染高峰，在40～45歲[21]。在中國(guó)，宮頸細(xì)胞學(xué)檢查正常的女性中，最常見的5個(gè)型別是HPV52(2.8%)、HPV16(2.7%)、HPV58(1.7%)、HPV33(1.1%)和HPV18(1.1%)[20]。

3、HPV疫苗國(guó)內(nèi)上市情況

接種HPV疫苗是阻斷HPV傳播的最經(jīng)濟(jì)、有效的手段[22-23]。早期動(dòng)物乳頭瘤病毒模型（棉尾兔乳頭瘤病毒）研究表明，以感染性病毒顆粒或者去除病毒DNA成分的病毒樣顆粒（virus-like particle,VLP）免疫動(dòng)物后，可以預(yù)防乳頭瘤病毒的感染，為研制HPV疫苗的可行性提供了證據(jù)[24-26]。在20世紀(jì)90年代初期，制備了HPV的VLP，證明了重組HPV疫苗的技術(shù)可行性[27]。同時(shí)期，眾多研究隊(duì)伍致力于HPV疫苗的研制，其基本技術(shù)路線的原理均為通過(guò)DNA重組技術(shù)體外表達(dá)HPV主要衣殼蛋白L1，利用其自組裝形成VLP的特性用作免疫原[28]。HPV L1形成的VLP可以使機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，從而阻止病毒感染，實(shí)現(xiàn)對(duì)宮頸癌等HPV相關(guān)疾病的有效預(yù)防。目前認(rèn)為，所有HPV疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性中和抗體均為L(zhǎng)1蛋白的構(gòu)象特異性抗體[29]。

2006年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)正式批準(zhǔn)默沙東公司生產(chǎn)的Gardasil HPV預(yù)防性疫苗上市。它是由釀酒酵母表達(dá)并純化的HPV6/11/16/18 L1VLP四價(jià)宮頸癌預(yù)防性疫苗。該疫苗被批準(zhǔn)用于預(yù)防9～45歲女性HPV6、11、16、18感染所引起的宮頸癌、陰道癌、外陰癌和肛門癌及癌前病變和生殖器疣[30]。這是FDA批準(zhǔn)的世界上第一個(gè)腫瘤疫苗。隨后，英國(guó)葛蘭素史克公司生產(chǎn)的商品名為Cervarix的HPV預(yù)防性疫苗也成功上市。它是來(lái)源于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的HPV16/18L1 VLP二價(jià)宮頸癌預(yù)防性疫苗，使用AS04佐劑（氫氧化鋁復(fù)合單磷酸脂質(zhì)A），每0.5ml的二價(jià)疫苗中HPV16/18的L1蛋白含量為20μg。這些成分吸附于含500μg氫氧化鋁和50μg 3-O-去?；?4'-單磷酰脂質(zhì)A的AS04佐劑系統(tǒng)中。該疫苗被批準(zhǔn)用于9～45歲女性，預(yù)防HPV16、18病毒感染引起的宮頸癌、宮頸原位腺癌及癌前病變[31]。2014年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)默沙東公司生產(chǎn)的重組九價(jià)HPV疫苗Gardasil9(HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58九價(jià)疫苗)上市，從而成為全球第三種已上市HPV疫苗。在我國(guó)，廈門大學(xué)聯(lián)合廈門萬(wàn)泰滄海生物技術(shù)有限公司研發(fā)生產(chǎn)的二價(jià)HPV疫苗馨可寧（Cecolin）在2019年被批準(zhǔn)上市。2022年，玉溪澤潤(rùn)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的二價(jià)HPV疫苗沃澤惠也成功上市。3款進(jìn)口疫苗價(jià)格昂貴且供應(yīng)有限，滿足不了全球疫苗接種的需求。馨可寧每劑售價(jià)約為Cervarix的一半，療效卻與Cervarix相似。馨可寧和沃澤惠對(duì)于9～14歲女性可采用2劑次接種。這2款國(guó)產(chǎn)疫苗的上市，很好地解決了進(jìn)口疫苗價(jià)格昂貴且供應(yīng)有限的問題，但這仍無(wú)法滿足全球日益增長(zhǎng)的疫苗接種需求。表1展示了我國(guó)已上市的5款疫苗概況。

4、重組三價(jià)HPV疫苗的研發(fā)及其創(chuàng)新性

目前全球HPV疫苗接種率仍不理想，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于世界衛(wèi)生組織2030年“健康人群”的目標(biāo)。因此需要加快疫苗的研發(fā)步伐，以滿足全球疫苗接種的需求。本公司積極響應(yīng)世界衛(wèi)生大會(huì)通過(guò)的《加速消除作為公共衛(wèi)生問題的宮頸癌全球戰(zhàn)略》及提出的“90%的女童在15歲前全程接種HPV疫苗”目標(biāo)，致力于重組HPV疫苗的研發(fā)。根據(jù)HPV流行病學(xué)數(shù)據(jù)，中國(guó)前3位的HPV致癌型別為：HPV16(59.5%）、H P V 1 8 (9.6%）、H P V 5 8(8.2%)[20]。本公司選擇大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)，以16、18、58型HPV病毒作為靶向病毒株，開發(fā)了重組三價(jià)人乳頭瘤病毒（16/18/58型）疫苗（大腸桿菌）（以下簡(jiǎn)稱重組三價(jià)HPV疫苗），用于預(yù)防HPV16、18、58感染和由此導(dǎo)致的宮頸癌等相關(guān)疾病，預(yù)防范圍達(dá)77.3%，比已上市二價(jià)HPV疫苗預(yù)防范圍增加了8.2%。本產(chǎn)品和已上市的疫苗技術(shù)路線基本相同，由單個(gè)HPV的主要衣殼蛋白L1，自動(dòng)裝配成VLP，其結(jié)構(gòu)和天然HPV顆粒幾乎沒有差別，具有良好的免疫效果。用基因工程表達(dá)的L1蛋白直接裝配出來(lái)的VLP大小、形態(tài)各異，穩(wěn)定性較差，還需要對(duì)其進(jìn)行純化：先解聚得到五聚體，再重新組裝成VLP。

HPV VLP疫苗工藝一般包括菌種庫(kù)建立、菌種發(fā)酵、菌體收獲、裂解、澄清純化、層析純化、VLP組裝、換液、除菌過(guò)濾等步驟。目前，VLP疫苗純化存在的問題主要有兩個(gè)方面：一方面是可溶蛋白少（產(chǎn)量低）、易形成無(wú)規(guī)則的聚集體；另一方面是宿主內(nèi)毒素和DNA殘留高。因此，我們對(duì)L1基因序列進(jìn)行了優(yōu)化：(1)從結(jié)構(gòu)入手，提高表達(dá)量，降低無(wú)規(guī)則聚集和蛋白降解。(2)從工藝優(yōu)化入手，以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)防止宿主內(nèi)毒素和DNA被VLP包裹。研究發(fā)現(xiàn)：HPV L1 N端參與五聚體間相互作用，但N端截短不超過(guò)9個(gè)（含9個(gè)）氨基酸時(shí)，不影響HPV L1五聚體形成VLP(T=7);C端不超過(guò)30個(gè)氨基酸的截短亦不影響形成由72個(gè)五聚體組成的VLP(T=7)[32-33]。由于全長(zhǎng)HPV L1蛋白不能或很難在大腸埃希菌中表達(dá)，采用N端截短的方式，可以提高大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HPV L1可溶性蛋白的表達(dá)量。采用C端截短的方式，可以減少L1蛋白降解，形成更多的、折疊正確的L1五聚體蛋白，減少多聚體的形成，使得L1蛋白在表達(dá)和純化過(guò)程中主要以可溶性五聚體形式存在，進(jìn)一步降低了純化難度，有利于提高純化收率和產(chǎn)量，均一的L1五聚體也保證了組裝后VLP的均一度，從而獲得高純度、均一性好的VLP，顯著改善了產(chǎn)品質(zhì)量，有效解決了VLP純化過(guò)程中純度和收率低的問題，實(shí)現(xiàn)了VLP的高效率組裝，為HPV VLP的研究提供了新的研發(fā)思路。

5、重組三價(jià)HPV疫苗免疫原性研究

HPV疫苗能夠誘導(dǎo)特異性中和抗體，保護(hù)機(jī)體免受病毒侵害。因此，疫苗成功的關(guān)鍵是誘導(dǎo)有效的體液免疫，產(chǎn)生具有保護(hù)作用的中和抗體，對(duì)中和抗體的水平和持久性的研究是評(píng)估疫苗保護(hù)效果的重要依據(jù)[34]。

5.1 重組三價(jià)HPV疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性研究

針對(duì)本公司自制的重組三價(jià)HPV疫苗開展免疫原性研究，以默沙東公司生產(chǎn)的Gardasil疫苗為陽(yáng)性對(duì)照，分別免疫小鼠，檢測(cè)血清中的中和抗體滴度水平，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

圖1中,黑色實(shí)線為重組三價(jià)HPV疫苗免疫后的中和抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化，紅色實(shí)線為相同劑量陽(yáng)性對(duì)照疫苗Gardasil免疫后的中和抗體滴度水平變化曲線。圖1中，中和抗體滴度以Log10表示，誤差棒表示95%置信區(qū)間。

從圖1可以看出，HPV16VLP產(chǎn)生的中和抗體滴度水平與陽(yáng)性對(duì)照疫苗基本一致；HPV18VLP產(chǎn)生的中和抗體滴度水平略高于陽(yáng)性對(duì)照疫苗；HPV58VLP產(chǎn)生的中和抗體在較高滴度水平。

5.2 重組三價(jià)HPV疫苗在大鼠體內(nèi)的免疫原性研究

針對(duì)本公司自制的重組三價(jià)HPV疫苗開展免疫原性研究，以默沙東公司生產(chǎn)的Gardasil疫苗為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定了重組三價(jià)HPV疫苗在大鼠中的免疫原性，并觀察了其免疫持久性（21周），檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

圖2中，黑色實(shí)線表示重組三價(jià)HPV疫苗免疫大鼠后測(cè)定的結(jié)合/中和抗體滴度平均值；紅色實(shí)線表示為陽(yáng)性對(duì)照疫苗Gardasil免疫大鼠后測(cè)定的結(jié)合/中和抗體滴度平均值。圖2中，結(jié)合/中和抗體滴度以Log10表示，誤差棒表示95%置信區(qū)間。

從圖2A、圖2C可以看出，HPV16、18 VLP產(chǎn)生的結(jié)合抗體滴度水平與陽(yáng)性對(duì)照疫苗基本一致；從圖2E可以看出，HPV58 VLP產(chǎn)生的結(jié)合抗體滴度水平較高。從圖2B、圖2D、圖2F可以看出，HPV16VLP產(chǎn)生的中和抗體滴度水平與陽(yáng)性對(duì)照疫苗基本一致，HPV18VLP產(chǎn)生的中和抗體滴度水平略高于陽(yáng)性對(duì)照疫苗，同時(shí)HPV58VLP產(chǎn)生了較高的中和抗體滴度。

圖1和圖2的結(jié)果表明，重組三價(jià)HPV疫苗可使小鼠和大鼠產(chǎn)生高滴度、持久性強(qiáng)的特異性中和抗體，且免疫效果與已上市疫苗相當(dāng)。未來(lái)，該疫苗有望成為進(jìn)口疫苗的有力競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手。

6、總結(jié)與展望

HPV感染引起的疾病一直是人類關(guān)注的焦點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織于2020年11月17日發(fā)布《加速消除宮頸癌全球戰(zhàn)略》（Launch of the Global Strategy to Accelerate the Elimination of Cervical Cancer），全球194個(gè)國(guó)家承諾共同消除宮頸癌，以期到2030年，HPV疫苗接種覆蓋率達(dá)90%、篩查覆蓋率達(dá)70%以及宮頸癌前病變和宮頸癌治療可及性達(dá)90%。HPV疫苗在預(yù)防宮頸癌方面發(fā)揮著非常重要的作用。在過(guò)去20年中，HPV疫苗研究快速發(fā)展，二價(jià)、四價(jià)和九價(jià)疫苗均已獲得上市許可，有效預(yù)防了全球HPV感染?？禈沸l(wèi)士采用原核表達(dá)系統(tǒng)研發(fā)了多款HPV疫苗，包括重組三價(jià)HPV疫苗，重組九價(jià)HPV疫苗，以及覆蓋全部高危型別的重組十五價(jià)HPV疫苗。這些HPV疫苗通過(guò)基因工程設(shè)計(jì)、生產(chǎn)工藝優(yōu)化等方式提高了產(chǎn)量，從而大大降低生產(chǎn)成本，未來(lái)將在預(yù)防HPV感染方面發(fā)揮重要作用。相信在全體科研人員的努力下，人類將不再受HPV感染的困擾。

引用本文：

劉玉瑩,陳曉,伍樹明,銀飛,劉永江*.人乳頭瘤病毒疫苗的概況及重組三價(jià)人乳頭瘤病毒疫苗的研發(fā)[J].中國(guó)食品藥品監(jiān)管,2023(12):85-91.