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一、常規(guī)化合物：

首先，看化合物是否有紫外吸收（這里的紫外吸收包括較微弱的紫外吸收，例如化合物只含有Boc基團、只有少量碳碳雙鍵，或同時含有少量不飽和鍵與Br原子等）；若有紫外吸收，且沒有對水很敏感的基團（在HPLC中會水解），則暫定使用HPLC進行分析；若無，且沸點不是太高（400℃以下）的話，則暫定使用GC進行分析。

 

備注：若紫外吸收太弱，例如：只有在200nm波長下才能出峰，峰高很低且峰型較差時，可根據(jù)化合物的沸點和性質(zhì)選擇使用LC-ELSD/CAD/MS檢測器或用GC進行分析。此處如果是單純看中控轉(zhuǎn)化率，該方法也可以使用，此時需要盡可能降低背景吸收（采用磷酸或磷酸鹽-乙腈的流動相體系），但如果是最終產(chǎn)品需要測定化合物的純度，這種做法就不行了。

     

二、常見的幾種情況如下：

1. 對于有紫外吸收的化合物，需要進一步看化合物的性質(zhì)，特別關(guān)注的點有：化合物的pKa（酸堿性），化合物的logP（極性）以及化合物在酸、堿性條件下是否會水解。若化合物會水解，則需要考慮其他檢測方法。

 

（1）若化合物為酸性，則需要使用酸性流動相（在水相中加入甲酸，三氟乙酸，磷酸，高氯酸等），一般從0.05%~0.1%的濃度開始；或者可以使用緩沖液（濃度一般從5~10mM開始，如磷酸鹽，碳酸銨，甲酸銨，乙酸銨等，采用磷酸/甲酸/乙酸/三氟乙酸調(diào)pH至酸性）。剛開始可采用甲酸/甲酸銨/乙酸銨-乙腈體系作為流動相以適配LCMS；

 

（2）若化合物為堿性，則需要使用偏堿性的流動相（磷酸鉀，碳酸銨，甲酸銨，乙酸銨，磷酸氫銨，三乙胺/二乙胺水溶液等，有需要的話還可以用氨水或三乙胺調(diào)pH至堿性）。剛開始可采用10mM甲酸銨/乙酸銨水溶液-乙腈體系作為流動相以適配LCMS；

 

（3）有機相首選乙腈（截止波長低，粘度小，洗脫能力較強），如果分離出現(xiàn)問題或者樣品在乙腈中會壞掉，再選擇甲醇。如果還有分離不開的現(xiàn)象，有機相可以采用乙腈，甲醇與THF中的任意兩種進行混合，調(diào)整混合的比例以得到合適的分離度。

 

（4）若化合物為中性，則首選10mM醋酸銨水溶液，也可以換成水作為流動相（儀器設(shè)備緊張時），但水作為流動相不太建議，除非能夠保證方法開發(fā)，驗證以及轉(zhuǎn)移階段用到相同性質(zhì)的水，否則不同的純化水可能會具有不同的pH。

 

（5）對于液相色譜柱的選擇，通常都從常規(guī)C18色譜柱開始嘗試，同時需要注意色譜柱pH的耐受范圍。對于某些特定結(jié)構(gòu)的化合物，還可以使用苯基柱，氰基柱，氨基柱，五氟苯基柱，HILLIC色譜柱（化合物極性大的時候可以嘗試使用，此時需要特別關(guān)注該類色譜柱的使用說明）等特殊色譜柱。

 

（6）當(dāng)HPLC分析方法中分離度不好時，首先嘗試調(diào)整梯度（同時將梯度變陡或者變緩）。如果調(diào)整梯度有分開的趨勢，則可以繼續(xù)嘗試，如果沒有，則需要考慮更換色譜柱或者流動相。此時需要根據(jù)化合物特定的基團來進行評估。比如化合物結(jié)構(gòu)中苯環(huán)或類似結(jié)構(gòu)較多，可采用苯基柱；若鹵素元素較多，可采用五氟苯基柱等。

 

（7）液相色譜柱，當(dāng)填料相同時，內(nèi)徑越細，顆粒粒徑越小，得到的分離度、靈敏度以及色譜峰的塔板數(shù)會越高（峰會變得更高更瘦）。但此時壓力會上升。需要根據(jù)需求選擇HPLC或UPLC，同時需調(diào)整流速。

 

（8）在液相分析中，有一種類型的化合物（帶醛基的化合物）比較特殊，有時候會出現(xiàn)峰型展寬的現(xiàn)象。這可能是由于化合物會出現(xiàn)醛基和烯醇基互變的現(xiàn)象，此時可以嘗試60℃的柱溫以及采用高氯酸或強堿性（pH9~11）的流動相，用以改善該類化合物的峰型。

 

2. 對于沒有紫外吸收的化合物，若沸點在400℃以內(nèi)（根據(jù)數(shù)據(jù)庫查詢到的數(shù)值）且高溫下不會分解，結(jié)構(gòu)不會發(fā)生變化，則可采用GC進行分析。后續(xù)根據(jù)化合物的特性基團、極性大小以及沸點高低，選擇合適的色譜柱以及氣相色譜儀的參數(shù)。

 

（1）帶氨基的化合物，可根據(jù)極性不同采用Rtx-5Amine、CP-Volamine（低極性）、Rtx-35Amine（中等極性）以及CP-51 Wax for Amine（高極性）等色譜柱。

 

（2）酸和醇類的化合物一般極性較大，可采用DB-FFAP（酸），HP-INNOWAX等色譜柱進行分析。

 

（3）普通化合物：可采用DB-1和HP-5（低極性）、DB-1701（中等極性）以及DB-WAX和HP-INNOWAX（高極性）色譜柱進行分析。

 

（4）鹽酸鹽類化合物：由于鹽的沸點非常高，此時可采用吸附樹脂或DBU的甲醇/乙腈溶液將鹽酸鹽除掉，然后將游離態(tài)（不帶鹽酸鹽的化合物）進氣相進行分析。也可以用液堿（氫氧化鈉/碳酸氫鈉水溶液）去除鹽酸鹽，之后采用有機溶劑對溶液進行萃取，將脫掉鹽酸鹽的化合物萃取到有機相中，進GC進行分析。

 

（5）若化合物沸點超過了柱子的最大耐受溫度，并不是不可以分析，因為在GC的載氣以及高壓條件下，化合物的沸點會有所降低。此時可采用膜厚較薄的色譜柱，這樣更利于將高沸點的化合物“吹出”。目前還有一些GC色譜柱的柱溫可達到400℃。

 

（6）采用氣相分析時，溶劑的選擇也有講究，如果化合物沸點在100℃以上，則可采用甲醇，乙腈，二氯甲烷等沸點較低的溶劑（直接進樣盡可能避免用到水，即使要用，水量也必須很少）；如果化合物沸點較低（100℃以下），則可采用DMF，DMSO或者NMP這類沸點較高的溶劑，這樣可以避免溶劑峰對化合物以及相關(guān)雜質(zhì)的干擾。

 

（7）載氣類型的選擇也有講究，通常情況下，首選氮氣，因為其便宜，且具有較好的惰性。如果采用氮氣時靈敏度達不到或分離度達不到，可以嘗試采用氫氣和氦氣，目前氦氣使用的情況越來越多，氫氣由于具有危險性，使用的較少。

 

（8）如果氣相出現(xiàn)分離度不佳的情況，首先嘗試將升溫程序變緩，如果效果不好，可以從載氣和色譜柱上下手。色譜柱的話需要換成內(nèi)徑更小的柱子。載氣可以將氮氣更換為氦氣。

 

（9）氣相色譜柱的膜厚越厚，可以消除一部分化合物極性高所帶來的峰型不好的影響，如果0.25um的柱子不合適，可采用1/3/5µm的色譜柱。例如有些帶羧基的化合物，如果沒有FFAP的柱子，也可以嘗試用DB-1的柱子，膜厚選用3/5µm。

 

（10）氣相色譜柱，極性越強，膜厚越厚，則相應(yīng)可耐受的最大溫度越低。在進行色譜柱選擇時需注意。

 

三、特殊化合物：

1.氨基酸類化合物：此類化合物極性很強，在GC中即便使用強極性的色譜柱也無法使其峰型變好。此時需采用液相進行分析。若該氨基酸有紫外吸收，則相對簡單一些，通常有以下兩種選擇：

 

（1）使用高氯酸（最強酸，抑制化合物解離）、五氟丙酸或七氟丁酸甚至九氟戊酸（離子對效應(yīng)）使其保留時間往后推移，但此時紫外吸收波長不宜太低（在205nm以下），否則會由較高的背景吸收，干擾化合物的出峰。

 

（2）采用HILLIC模式，使原本極性很強的氨基酸類化合物的保留時間變大。但此時需注意HILLIC模式以及相應(yīng)色譜柱的使用條件（柱溫，有機相比例不超過50%等）。

 

（3）若該氨基酸沒有紫外吸收，則需要采用ELSD或者CAD檢測器進行檢測。流動相采用五氟丙酸或七氟丁酸，使化合物保留時間往后移。（此時的重點是調(diào)整檢測器參數(shù)，霧化溫度、漂移管溫度等，以得到較合適的靈敏度。）

 

2.有紫外吸收但是遇水水解的化合物（硼酸酯類化合物等），此時有以下幾種解決思路：

 

（1）使用正相色譜進行分析，采用純有機相作溶劑，防止其水解。但需要評估其在有機溶劑（正相流動相、甲醇或乙醇等）中的溶解性以及出峰情況。

 

（2）換用GC進行分析，但此時需要評估其高溫是否穩(wěn)定以及沸點如何。

 

（3）如果沸點太高，需嘗試對其進行硅烷化衍生以降低沸點，評估衍生條件后采用GC分析。

 

（4）還可以采用衍生的方法，嘗試將容易水解的基團衍生掉，評估衍生條件后采用HPLC進行分析。

 

3.沒有紫外吸收但高溫不穩(wěn)定的化合物：

 

（1）此時可以使用HPLC-ELSD/CAD的方式進行分析，也可采用LCMS進行分析，查看TIC流或者通過提取分子量的方式（SIR模式）對化合物及相關(guān)雜質(zhì)進行分析。

 

（2）可以使用衍生的方法使其具有紫外吸收。如果對于特定基團的化合物（鹵素等），還可采用ECD檢測器進行嘗試分析。

 

4.無紫外吸收且沸點很高的化合物：

 

（1）采用衍生的方式，將沒有紫外吸收的化合物衍生上具有紫外吸收的基團（丹磺酰氯、Fmoc-Cl等，需要化合物有活潑氫），進而采用HPLC進行分析。此時重點是搞清楚衍生條件，使得衍生可以完全，且衍生試劑的色譜峰不能對分析檢測有影響。此類型的衍生一般會在堿性條件下進行，此時需要確認化合物是否會在堿性條件下壞掉。

 

（2）采用衍生方式，采用硅烷化試劑對化合物進行衍生，進而降低其沸點，使其可以采用GC進行分析。此時依然要搞清楚衍生的條件，且衍生試劑的峰不能對分析檢測有影響。硅烷化衍生時，需要在60~70℃的溫度下，將樣品與硅烷化試劑反應(yīng)0.5~1h，然后對樣品進行過濾后進樣檢測。

 

（3）使用HPLC-ELSD/CAD的方式進行分析，也可采用LCMS進行分析，查看TIC流或者通過提取分子量的方式對化合物及相關(guān)雜質(zhì)進行分析。

 

5.無紫外吸收且極性很大的化合物（酸性化合物，帶1~2個羧基）：

 

同4中內(nèi)容。此時硅烷化不僅是為了降低沸點，也是為了降低極性，使化合物的峰型更好看，更對稱。

 

四、異構(gòu)體(對映異構(gòu)體)分析：

 

1.有紫外吸收的異構(gòu)體：

 

（1）使用正相色譜進行分析，通常先從AD-H的色譜柱開始嘗試，并進一步調(diào)整流動相比例以及種類，常用流動相為（正己烷/正庚烷-異丙醇/乙醇）；此時也需要根據(jù)化合物的性質(zhì)（酸堿性）在流動相以及溶劑中添加酸/堿（常用三氟乙酸/二乙胺等）；

 

（2）如果是氨基酸類化合物，此時采用常規(guī)的正相色譜柱無法有效進行分離，則可采用硅醚類（冠醚類）固定相的正相色譜柱，在正相或者反相的條件下進行化合物異構(gòu)體的分離；此時，流動相中需要加入緩沖對以降低氨基酸類化合物的解離。

 

（3）如果該化合物沸點不是特別高，且HPLC不適用的情況下，可以嘗試采用GC，使用氣相色譜專用的手性柱（Rtx-βDEX225等）進行分析。

 

2.無紫外吸收的異構(gòu)體，通常有3種解決思路：

 

（1）采用GC進行分析，此時需要用到氣相專用的手性柱。有些化合物則可能需要進行進一步的衍生才能使異構(gòu)體之間得到分離。例如乙?；?。

 

（2）可采用衍生的方式使其具有紫外吸收，再以常規(guī)的正相/反相色譜對其進行分析。此時的重點依然是要評估好化合物的衍生條件。

 

（3）采用HPLC串聯(lián)ELSD或CAD檢測器的方式進行檢測，色譜柱需使用反相的手性柱。因為正相色譜的流動相體系不容易揮發(fā)，最好使用反相色譜的流動相體系。

 

五、殘留溶劑分析：

 

1.常規(guī)化合物的殘留溶劑：

 

采用直接進樣或者頂空進樣的方法進行檢測（根據(jù)溶劑本身的沸點，特性以及靈敏度）。若是胺類化合物需采用胺類專用氣相色譜柱，酸性化合物用FFAP的色譜柱等。常規(guī)的一些殘留溶劑，使用DB-624色譜柱可以覆蓋大部分。這里需要注意的是，有些溶劑并不可以使用頂空進行分析（比如非常容易揮發(fā)的化合物），此時需查閱相關(guān)文獻，后續(xù)改為直接進樣的方法進行檢測。

 

2.鹽類化合物/無機鹽的殘留溶劑：

 

此時需要用水作為溶劑，故不能采用直接進樣的方式進行分析。須采用頂空進樣的方法。且頂空參數(shù)中的爐溫（OVEN）不能高于90℃（最好不超過85℃）。

 

六、雜質(zhì)分析：

 

1.常規(guī)雜質(zhì)分析：

 

對于未知雜質(zhì)，首先需要看看此雜質(zhì)是什么結(jié)構(gòu)（LCMS&GCMS&NMR等手段）以及雜質(zhì)在當(dāng)前的分析條件下會不會出現(xiàn)變壞降解的情況，后續(xù)需根據(jù)雜質(zhì)的檢出水平，工藝對雜質(zhì)的去除能力（或雜質(zhì)去向）以及雜質(zhì)對于最終產(chǎn)品的風(fēng)險大小來制定合適的限度，比如：0.05%，0.5%，0.1%等。如果是已知雜質(zhì)，則可以更方便的評價其風(fēng)險以及工藝過程中的雜質(zhì)去向。除此之外，更重要的是要搞清楚雜質(zhì)與主成份的響應(yīng)差異。液相方法用到的UV檢測器比較多，通常是根據(jù)雜質(zhì)與主成分的最大吸收波長來確定分析方法中的波長。當(dāng)然，不同檢測器的條件下，雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)差異都是不一樣的，如果雜質(zhì)可以做出來或買到，就需要與主成分在相同濃度下比較響應(yīng)差異，后續(xù)的方法開發(fā)中也要進行初步的校正因子的考察，為后續(xù)的方法驗證做準(zhǔn)備。

 

如果是氣相方法，F(xiàn)ID檢測器用到的比較多，此時需要根據(jù)雜質(zhì)和主成分之間含碳量的多少來看響應(yīng)差異。也需要做一下雜質(zhì)與主成分在相同濃度下的響應(yīng)差異以及初步的校正因子。如果響應(yīng)差異太大，則需要謹(jǐn)慎評估該雜質(zhì)的限度制定。上述工作都是為了更準(zhǔn)確的確定雜質(zhì)的含量。

 

2.特殊雜質(zhì)分析：

 

如果是基因毒性雜質(zhì)或者限度需要控制很低的雜質(zhì)，此時常規(guī)的分析方法靈敏度不一定可以達到。就可能要采用LCMS的SIR模式，GCMS的SIM模式，LCMSMS儀器，柱前/柱后衍生或者頂空進樣方式（頂空進樣主成分可以過載很多）來進行分析。還可以根據(jù)雜質(zhì)的特性選擇特異性的檢測器如電導(dǎo)檢測器或ECD檢測器對其進行檢測。根據(jù)具體問題選擇相應(yīng)的檢測方法。

 

3.金屬離子/元素檢測：

 

此時可采用ICP-MS（電感耦合等離子串聯(lián)質(zhì)譜）和ICP-QES（電感耦合等離子串聯(lián)OES）或者AA（原子吸收光譜-石墨爐）進行分析。有些情況下還可以使用離子色譜進行分析。當(dāng)使用ICP進行分析時，化合物需要是溶液的狀態(tài)，如果可溶于水，則比較方便，可以直接用水配樣進行檢測，如果不溶于水，則需要加入硝酸或其他試劑進行消解，也就是將化合物結(jié)構(gòu)破壞掉，最終用水定容，進樣檢測。消解的時候需要有專門的消解儀進行加壓加熱消解，而且加入酸的量也不能過高，否則會污染ICP的進樣錐，導(dǎo)致檢測結(jié)構(gòu)不準(zhǔn)確。

 

4.離子檢測：

 

多數(shù)情況下采用離子色譜進行檢測，離子色譜通常配備的是電導(dǎo)檢測器。需要根據(jù)離子的種類采用不同的模式。對于陰離子，流動相首選氫氧化物、碳酸鹽等。對于陽離子，流動相首選硫酸，甲基磺酸等。流動相中一般沒有有機溶劑或僅有微量的有機溶劑。色譜柱的選擇則根據(jù)不同的離子種類選擇特定的離子色譜柱以及預(yù)柱。

 

對于某些離子的檢測，還可以采用衍生的方式，使其反應(yīng)后具有紫外吸收，這樣便可以采用HPLC進行分析，此時，評估衍生的條件以及專屬性非常重要。

 

七、水分檢測：

 

對于水分測定，目前最常用的有兩種方法，一個是干燥失重，一個是KF法。KF法比較快速，比較靈敏，所以目前最常用。干燥失重需要根據(jù)化合物的熔點來設(shè)定干燥時候的溫度以及條件。

 

（1）對于可溶解于KF試劑的且不會污染電極的化合物，可以直接用KF水分儀進行滴定，若化合物中含有醛或酮，則需要采用醛酮類的KF試劑進行水分測定；

 

（2）待測物如果是酸性化合物，需要往里加入一定量的堿（咪唑等），如果是堿性化合物，需要加入一定量的酸（苯甲酸或水楊酸），以防止測定結(jié)果不準(zhǔn)（KF滴定在pH5.5~8的范圍內(nèi)進行的最快，所以pH不等低于4，也不得大于8）；

 

（3）待測物如果是液體，可以直接分析，如果是固體，需要碾碎，且如果不溶于無水甲醇時，需要采用助溶劑（乙腈、甲苯，甲酰胺和氯仿等）進行助溶或采用其他的溶劑代替無水甲醇；

 

（4）當(dāng)水分含量多或者少時，為了獲得更加準(zhǔn)確的水分檢測數(shù)據(jù)，KF滴定劑的濃度可以進行選擇，水分含量多（樣品易吸水時），可選擇高濃度的滴定劑（5mg/ml），反之，選擇低濃度的滴定劑。要保持最終的消耗體積在1.5~3.5ml為宜。

 

（5）以下情況不能用KF法測定水分：

 

化合物與KF試劑反應(yīng)（例如：鹽、氫氧化物與氧化物-與KF試劑中的HI反應(yīng)；強酸-與甲醇發(fā)生反應(yīng)生成水；醛酮類化合物-與甲醇化合形成縮醛或縮酮并釋放水分；硅烷醇和硅氧烷-與甲醇酯化生成水；金屬過氧化物；強氧化劑-與KF試劑反應(yīng)；含硼化合物：硼酸和甲醇發(fā)生脂化反應(yīng)生成水。等）。

 

樣品會消耗碘或釋放碘（例如：鐵鹽、酮鹽、亞硝酸鹽、硫代硫酸鹽等），會導(dǎo)致水分結(jié)果偏高。

 

（6）若化合物會污染電極，或不溶于KF試劑，則此時不能采用常規(guī)的KF法進行測定，需要使用干燥失重或是帶加熱爐的KF水分測定儀。將水分蒸發(fā)出后吸取到滴定模塊，進而進行水分測定。

 

八、滴定分析：

 

通常用于化合物的含量測定以及某些離子（如氯離子）的測定。通常都是酸堿滴定（水溶液與非水溶液滴定）、氧化還原滴定（錳量法，碘量法，鈰量法，重鉻酸鹽，重氮法）、絡(luò)合滴定（EDTA滴定）以及沉淀滴定（濁度與銀量法）。

 

（1）對于酸堿滴定，就需要選擇合適的酸或者堿。有羧基，一般使用NaOH，有氨基，一般使用高氯酸或鹽酸。在非水滴定（當(dāng)帶測物的酸性和堿性弱、不溶于水或與水發(fā)生反應(yīng)時使用該模式）中，通常會有鹽酸的異丙醇溶液，高氯酸的冰醋酸溶液，氫氧化鉀的乙醇溶液，甲醇鈉的氯苯溶液，四丁基氫氧化銨的異丙醇/甲醇溶液等。

 

（2）對于氧化還原滴定，需要根據(jù)滴定時發(fā)生的反應(yīng)去選擇合適的指示劑以及滴定液（碘標(biāo)液、硫代硫酸鈉、高錳酸鉀、碘酸鉀、硫酸鈰、溴標(biāo)液、溴酸鉀、重鉻酸鉀等），目前用到電位滴定比較多，故指示劑用到的比較少。

 

（3）對于鹽酸鹽類化合物，如果要進行滴定，需要加入一定量的醋酸汞將鹽酸屏蔽掉，再用高氯酸進行滴定。

 

（4）但如果待測化合物以及其相關(guān)雜質(zhì)均含有相同的基團（例如都有氨基），此時滴定測含量是不準(zhǔn)確的，因為雜質(zhì)也會消耗滴定劑。

 

（5）在滴定的時候，滴定儀的參數(shù)選擇也會影響結(jié)果，比如攪拌時間，滴定的速度，閾值設(shè)置等；此外，滴定液的濃度，電極的使用也會影響到含量結(jié)果。這些都是需要注意的點。

 

（5）這方面內(nèi)容需要根據(jù)經(jīng)驗積累，可以翻看藥典種的滴定方法以及網(wǎng)上的文獻資料。加強對滴定分析以及電位滴定儀的了解。