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從事這個行業(yè)這么多年，也曾經接觸到過一些低波長的項目，但是最近半年比較集中，新接的幾個項目均是低波長，甚至有個項目有關物質的檢測波長是190nm，再加上操作過程需要用有機溶劑萃取，因此試驗過程很是波折，所幸的是問題都一一解決了，現將個人經驗總結分享一下。

低波長的困境主要是因為末端吸收，并不是在比較低的檢測波長下產生雜質，而是在比較低的波長下，很多物質有不同程度的吸收，對波長較短的待測物質的特征吸收產生干擾，因此在選擇特征波長時候，盡量避免選擇低波長。但是有些情況下，為了能更好的達到分析的效果，我們又不能不選擇低波長，這也是不能越過去的坎。如果選擇的是低波長的話，在分析方法開發(fā)的前期，首先進行專屬試驗。這個需要分開來講，如果是溶出的研究的話，專屬試驗包括各個介質的專屬干擾試驗，還有就是全輔料（包含膠囊殼或包衣粉）的專屬干擾試驗，如果各個介質以及在相對應的介質下全輔料沒有干擾待測主峰的雜峰的話，低波長測溶出及溶出曲線是沒有問題的。含量的專屬試驗比較簡單， 進一針空白溶劑，如果沒有干擾待測主峰的雜峰的話，低波長檢測含量也是沒有問題的。但是，有關物質的研究就比較復雜了，不僅僅是對主峰的干擾情況，更重要的是對各個已知雜質及未知雜質的干擾。這里重點以制劑有關物質為例，介紹常見的一些干擾情況及應對策略。

剛開始接觸一個新的項目在做有關物質方法開發(fā)時，首先要進行專屬試驗：溶劑干擾試驗和全輔料的干擾試驗，這個簡單，就是將配置樣品的溶劑及處方量的全輔料，依次注入液相色譜儀，如果溶劑或者全輔料對主峰或者各個已知雜質和未知雜質均沒有干擾，就證明低波長的選擇沒有問題。但是退一步來講，低波長下溶劑或者全輔料（包含膠囊殼或包衣粉）在某一固定位置規(guī)律出峰，就是確定溶劑或者全輔料出峰，第一個先需要確認是不是干擾主峰的測定，再次確認是不是干擾各個已知雜質和未知雜質的測定，如果均沒有干擾，且在此低波長下各個已知雜質和未知雜質及主峰均能有效分離，就證明低波長選擇的沒有問題，在進行雜質計算時，我們可以通過扣除法進行計算，就是將固定的相對保留時間的溶劑峰或者輔料峰進行扣除進行計算。

最近在做一個新的項目，檢測波長是210nm，在此條件下，各個已知雜質和未知雜質以及主峰之間均能有效分離，但是在對保留時間約1.24和1.30位置，出了2個雜峰，原料和溶劑在此位置均不出峰，全輔料溶液和制劑溶液均出峰，證明是由于全輔料引起的，通過單個的輔料逐一調查，確定是由硬脂酸鈣引起的，雖然更換不同廠家的硬脂酸鈣，在此2個位置依然出雜峰，參比制劑也有同樣的雜峰，且通過加速試驗預穩(wěn)定性，此2個雜峰均不增長，相對位置比較固定，因此，我們的策略就是按照扣除相對保留時間為1.24和1.30的雜峰進行計算。

但是我們最大的困惑往往在于較低波長下，在日常的檢測中，非溶劑和全輔料引起的其他干擾的雜峰出現，并且忽大忽小，沒有規(guī)律。原因大多如下：

1、高效液相色譜儀系統(tǒng)

對于整個液相系統(tǒng)而言，任何一個單元都容易引起干擾，但是常常最容易出現問題的包括一下幾點：流動相瓶、單向閥、過濾頭、檢測器。

1、單向閥和過濾頭：單向閥和過濾頭首當其沖是最容易出現污染的地方，污染物分2種，一種是容易溶于水的鹽類，另一種是易溶于有機相的有機雜質，我一般的解決方式如下：把單向閥和過濾頭拆卸下來，使其完全浸入盛有純化水的燒杯中，超聲5~10分鐘，重復1~2次（目的是除去易溶于水的鹽類），然后同樣的操作，使其完全浸入盛有有機相（如甲醇或者乙腈）的燒杯中，超聲5~10分鐘，重復1~2次（目的是除去易溶于有機相的有機雜質），然后在折返過來，再次使其完全浸入盛有純化水的燒杯中，超聲5~10分鐘，重復1~2次，甩干或者晾干，安裝。按照正常的流程進行下一步的操作。

2、溶劑瓶：盛放流動相的溶劑瓶幾乎每天都在不停的更換流動相，因此，正常的沖洗可能不會有影響，但是對于低波長的項目的話，就液相就容易抓取到不易發(fā)現的雜質，導致色譜圖中出現異常不規(guī)律的雜質峰。因此，我一般的做法是，正常沖洗以后，用純化水反復清洗溶劑瓶后倒扣桌面上10~20分鐘。在用流動相反復沖洗后倒扣桌面上10~20分鐘，以此來消除溶劑瓶污染帶來的干擾。

3、檢測器：為了防止檢測器污染，或者是日常檢測器的維護，我一般是管路不經過色譜柱，直接連接到檢測上，低流速用熱水重新30分鐘， 然后將接到檢測器的管路反接，同樣低流速用熱水沖洗30分鐘。

4、流動相：我們一般的流動相使用期限是3~7天，但是對于低波長有關物質的檢測來說不太友好，譬如，流動相放置的過程中，容易從空氣中撲捉到有機雜質，并且，夏天的話，溶劑滋生細菌，細菌及其代謝產物容易導致產生干擾峰，這樣的話，流動相最好是臨用新制。

5、試劑：盡可能使用較高級別的HPLC試劑，不用質疑，純度更高的試劑或者溶劑，

純度更高，雜質更少，干擾更小。

2、過程的干擾

1、塑料制劑的干擾：這個也是產生干擾的最大因素。

如塑料稱量勺，塑料滴管，塑料燒杯，主要是有機溶劑腐蝕塑料后，產生的雜質。曾經做過一個試驗，從容量瓶到移液管到進樣小瓶，均是玻璃材質，稱量勺也用的是鐵勺， 但是依然有干擾峰，重新用同樣廠家的試劑試藥配置溶劑后干擾峰消失，各種原因調查后，原來發(fā)現是第一次配置的溶劑，為了防止溶劑污染，曾經短暫的用保鮮膜蓋住燒杯，但是這個過程，保鮮膜覆著與溶劑液面上，就造成了污染。

2、進樣系統(tǒng)的干擾：包括進樣小瓶，小瓶蓋，小瓶墊，

最近在做另一個試驗，專屬溶劑，均沒有干擾， 但是連3份樣品的重復性預試驗依

然無法重復，不同位置產生不同的干擾峰，并且在連續(xù)3份的對照溶液中，也是不規(guī)律的產生干擾峰，后來就逐一排查原因，發(fā)現是同一廠家同一批次進樣小瓶，但是由于用不同的進樣小瓶墊導致。首先進樣小瓶墊是重復使用的，由于進樣小瓶墊清洗的過程中，屬于一直漂浮在洗液的表面（不能沉入洗液中），進樣墊經多次重復使用后，小瓶墊的中心位置被多次扎，有其他的污染物附著與小孔內，小孔內的污染物無法清理掉，導致外來物質的殘留，從而產生的污染。

3、選擇孔徑更小，更有質量保障的大品牌濾膜。譬如，實驗室常規(guī)的濾膜孔徑是0.45µm，可以選擇0.22µm的濾膜，以過濾除去潛在的雜質。

總而言之一個字“凈”，干凈，潔凈，各種措施和舉措盡可能避免污染，盡可能最大化減少各個步驟的污染。