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細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜中的一種組分，主要成分是脂多糖，后者由細(xì)菌細(xì)胞壁合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，細(xì)菌死亡或自溶后會(huì)從細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)中釋放出來(lái)，能導(dǎo)致人體發(fā)熱、休克甚至死亡。

 

革蘭陰性菌的典型菌群有大腸桿菌、傷寒桿菌、淋球菌、腦膜炎球菌、志賀菌、結(jié)核桿菌，痢疾桿菌等。這類菌群的致熱性除全菌體和胞壁中所含的肽聚糖外，最突出的是其胞壁中所含的內(nèi)毒素。

 

所以，內(nèi)毒素是革蘭陰性菌的主要毒力因子。內(nèi)毒素檢測(cè)方法一般有凝膠法和光度測(cè)定法。

 

1、檢測(cè)方式對(duì)比

 

凝膠法分為凝膠限度法和凝膠半定量法；光度測(cè)定法又分為濁度法和顯色基質(zhì)法，其中濁度法分為動(dòng)態(tài)濁度法和終點(diǎn)濁度法，顯色基質(zhì)法分為動(dòng)態(tài)顯色法和終點(diǎn)顯色法。

 

不同檢測(cè)方法的比較，見下表：

 

 

 

2、凝膠法

 

凝膠法是利用鱟血液中的變性細(xì)胞， 經(jīng)裂解液和機(jī)械方式促使細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解物， 能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)， 反應(yīng)的速度和凝膠的堅(jiān)固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)。

 

1.細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢測(cè)所需主要設(shè)備  

 

（1）電熱干燥箱。 

 

（2）旋渦混合器。 

 

（3）超凈工作臺(tái)。 

 

（4）試管恒溫儀、恒溫水浴箱或恒溫培養(yǎng)箱。 

 

（5）鱟試劑。是從鱟的血液中提取出的凍干試劑，可以與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)。 

 

（6）細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品。 

 

（7）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水應(yīng)符合《中國(guó)藥典》規(guī)定的滅菌注射用水標(biāo)準(zhǔn)，其內(nèi)毒素含量小于0.015EU/mL（用于凝膠法）或0.005 EU/mL（用于光度測(cè)定法），且對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾作用。 

 

（8）實(shí)驗(yàn)所用器皿：需經(jīng)處理，去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃，至少30分鐘）去除，若使用塑料器具，如加樣吸頭等應(yīng)置30%雙氧水中浸泡4h，再用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水充分沖洗后置60℃烘干備用。也可以選擇標(biāo)明無(wú)熱原的商業(yè)產(chǎn)品。 

 

（9）試驗(yàn)常用材料器具：剪刀、砂輪、廢品缸（收集碎玻璃）、無(wú)熱原試管（10 mm×75 mm）、匹配的試管架、封口膜、酒精棉球、時(shí)鐘、移液器及無(wú)熱原吸頭。 

 

2.鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

 

當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。 

 

目的為考察鱟試劑的靈敏度是否準(zhǔn)確，同時(shí)也考查檢驗(yàn)人員操作方法是否正確及試驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。 

 

3.供試品干擾試驗(yàn)

 

干擾實(shí)驗(yàn)的目 的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對(duì)內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用， 為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。并且驗(yàn)證當(dāng)供試品的配方和工藝有變化， 鱟試劑來(lái)源改變或供試品陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果呈陰性時(shí)供試品是否存在干擾作用。由于干擾實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常， 與所使用鱟試劑的靈敏度無(wú)關(guān)， 因此在干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。但建議使用較低靈敏度(如 0.5 或 0.25EU／ m1)的鱟試劑， 可盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對(duì)干擾實(shí)驗(yàn)造成的陽(yáng)性影響。

 

（1）對(duì)未知或可疑的供試品初次進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)之前應(yīng)先進(jìn)行干擾試驗(yàn)，目的是檢驗(yàn)供試品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)是否有抑制或增強(qiáng)作用，以及其他影響細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)準(zhǔn)確性和敏感性的干擾作用。 

 

（2）當(dāng)鱟試劑、供試品來(lái)源、供試品配方或生產(chǎn)工藝有變化或其他任何可能影響細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)結(jié)果的試驗(yàn)條件改變時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 

 

（3）每種產(chǎn)品應(yīng)取3批，并分別使用不少于兩個(gè)制造商生產(chǎn)的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 

 

4.試驗(yàn)準(zhǔn)備 

 

（1）確認(rèn)所需試驗(yàn)的試劑：鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水  

 

（2）確認(rèn)所需試驗(yàn)的器具材料（如上）  

 

5.試驗(yàn)方法

 

（1）同一批號(hào)選取至少3各單位供試品； 

 

（2）供試液的制備：供試品應(yīng)使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水為浸提介質(zhì)。根據(jù)本單位產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定浸提介質(zhì)的體積。 

 

6.凝膠法操作方法

 

（1）細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備(按說(shuō)明書進(jìn)行）  

 

（2）鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)  

 

根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λ），將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘或參照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書中要求的混勻時(shí)間進(jìn)行操作，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒或參照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書中要求的混勻時(shí)間進(jìn)行操作。取不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別與等體積（如0.1mL）的鱟試劑溶液混合，每一個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外取2管加入等體積的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。 

 

圖片

將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)，造成假陰性結(jié)果。 

 

當(dāng)最大濃度2λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λc）。 

 

λc=antilg（∑X/n）  

 

式中　X 為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(lg)。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度； 

 

n 為每個(gè)濃度的平行管數(shù)。 

 

當(dāng)λc在0.5～2λ(包括0.5λ和2λ)時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。 

 

（3）干擾試驗(yàn)  

 

a、應(yīng)開展干擾試驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定供試品的最小不干擾稀釋倍數(shù)；采用多個(gè)不同稀釋倍數(shù)的供試品溶液，如某醫(yī)療器械產(chǎn)品限值為20EU/件，鱟試劑靈敏度為0.25EU/mL,按MVD=L/λ，【20EU/件÷0.25EU/mL=80】，則其最大有效稀釋倍數(shù)為80mL/件。 

 

b、在預(yù)定的稀釋倍數(shù)下開展正式干擾試驗(yàn)  

 

按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。 

 

只有當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，試驗(yàn)方為有效。當(dāng)系列溶液B的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。其他情況則認(rèn)為供試品在該濃度下存在干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過(guò)MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)。 

 

可通過(guò)對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過(guò)其他適宜的方法(如過(guò)濾、中和、透析或加熱處理等)排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過(guò)處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 

 

（4）凝膠限度試驗(yàn)  

 

按表2制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數(shù)不超過(guò)MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來(lái)制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。 

 

（5）結(jié)果判斷  

 

保溫60分鐘±2分鐘后觀察結(jié)果。 

 

若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B的平行管均為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照溶液C的平行管均為陽(yáng)性，試驗(yàn)有效。 

 

若溶液A的兩個(gè)平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。 

 

若溶液A的兩個(gè)平行管均為陽(yáng)性，判定供試品不符合規(guī)定。 

 

若溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽(yáng)性，另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定。 

 

若供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD而溶液A結(jié)果出現(xiàn)不符合規(guī)定時(shí)，可將供試品稀釋至MVD重新實(shí)驗(yàn)，再對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。 

 

7.如供試品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)有干擾，

 

可選用下列方法排除干擾： 

 

（1）使用更靈敏的鱟試劑對(duì)供試液進(jìn)行更大倍數(shù)稀釋； 

 

（2）采用無(wú)熱原氨基甲烷緩沖液稀釋供試液； 

 

（3）采用無(wú)熱原氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)供試液pH值在6.0~8.0范圍內(nèi)； 

 

（4）采用陽(yáng)離子緩沖液稀釋供試液以調(diào)節(jié)離子濃度。  

 

8.注意事項(xiàng)

 

（1）試驗(yàn)操作應(yīng)在清潔環(huán)境中進(jìn)行，過(guò)程中應(yīng)防止內(nèi)毒素的污染。在使用移液器取樣時(shí)，應(yīng)注意不要將移液器中的氣體吹入溶液中。 

 

（2）試驗(yàn)操作過(guò)程中人員應(yīng)做好防護(hù)，避免割傷或內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品感染。 

 

（3）開啟細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑時(shí)，先輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，藍(lán)點(diǎn)向外，75%酒精棉球擦拭后啟開，啟開過(guò)程中應(yīng)防止玻璃碎片落入瓶?jī)?nèi)。  

 

（4）溶解鱟試劑及混勻供試品和鱟試劑時(shí)，試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意更換吸頭，以避免檢查用水的污染及溶液的交叉污染。 

 

（5）由于凝集反應(yīng)是不可逆的，所以在反應(yīng)過(guò)程中及觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)注意不要使試管受到振動(dòng)，使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性結(jié)果。 

 

（6）進(jìn)行干擾試驗(yàn)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照系列和含內(nèi)毒素的供試品溶液系列應(yīng)同時(shí)進(jìn)行；如經(jīng)檢驗(yàn)證實(shí)供試品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)有不能排除的干擾作用則不適宜采用凝膠限度法。 

 

（7）在進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)，各個(gè)試驗(yàn)中要求的對(duì)照應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，并在試驗(yàn)有效的情況才能進(jìn)行計(jì)算和判斷。  

 

（8）2020版《中國(guó)藥典》1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度測(cè)定法。供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠限度試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。 

 

3、光度法

 

光度檢測(cè)法包含濁度法和顯色法

 

1、濁度法

 

此方法是通過(guò)利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)發(fā)生濁度變化測(cè)定內(nèi)毒素的含量?；诖嗽囼?yàn)原理，可以分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是基于內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)混合物在培養(yǎng)一段時(shí)間后的濁度（吸光度或透光率）的量化關(guān)系。動(dòng)態(tài)濁度法是測(cè)定反應(yīng)混合物達(dá)到預(yù)定吸光度或透光率需要的時(shí)間（初動(dòng)時(shí)間）或濁度增加的速度的方法。進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)時(shí)需要在鱟試劑生產(chǎn)商建議的培養(yǎng)溫度下進(jìn)行（通常是37 ±1℃）。

 

2、顯色法

 

此方法是一種通過(guò)測(cè)定鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)產(chǎn)生的縮氨酸釋放出的顯色基團(tuán)的來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)的方法。基于以上特殊的試驗(yàn)原理，此方法可以分為終點(diǎn)顯色法與動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是基于內(nèi)毒素的濃度與孵育結(jié)束時(shí)所釋放的顯色基團(tuán)的量化關(guān)系的一種試驗(yàn)方法。動(dòng)態(tài)顯色法是測(cè)定反應(yīng)混合物達(dá)到預(yù)定的吸收度所需要的時(shí)間或其顏色增長(zhǎng)的速度。進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)時(shí)需要在鱟試劑生產(chǎn)商建議的培養(yǎng)溫度下進(jìn)行（通常是37±1℃）。

 

3、光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)及供試品干擾實(shí)驗(yàn)

 

為保證濁度和顯色試驗(yàn)的有效性，應(yīng)預(yù)先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)以及供試品的干擾試驗(yàn)。

 

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)

 

對(duì)每一批次的鱟試劑均需要進(jìn)行此項(xiàng)試驗(yàn)。用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，需至少制備三個(gè)濃度的內(nèi)毒素溶液，這些濃度需要在鱟試劑生產(chǎn)商所標(biāo)示的靈敏度范圍內(nèi)。根據(jù)鱟試劑的生產(chǎn)商的說(shuō)明書（如：體積比，孵育時(shí)間，溫度，pH等），試驗(yàn)時(shí)每一標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度至少做3個(gè)平行樣。

 

如果在動(dòng)態(tài)試驗(yàn)方法中，預(yù)期的范圍大于2個(gè)對(duì)數(shù)，應(yīng)增加額外的標(biāo)準(zhǔn)，使得每個(gè)對(duì)數(shù)增加在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)。設(shè)定的內(nèi)毒素的濃度范圍的相關(guān)系數(shù)，其絕對(duì)值|r|必須大于或等于0.980。

 

5、干擾實(shí)驗(yàn)

 

按照表格配制溶液A、B、C、D，按使用的鱟試劑的相關(guān)說(shuō)明對(duì)溶液A-D進(jìn)行試驗(yàn)，例如：關(guān)于供試品溶液及鱟試劑溶液的體積，供試品溶液與鱟試劑溶液的體積比，孵育時(shí)間等。 

 

當(dāng)試驗(yàn)滿足以下條件時(shí)，該實(shí)驗(yàn)被認(rèn)為是有效的：

 

1.  用溶液C的建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值大于或等于0.980。

 

2. 溶液D的試驗(yàn)結(jié)果不超過(guò)所使用的鱟試劑的空白限度或小于所使用的鱟試劑的內(nèi)毒素檢測(cè)限度。

 

3. 由溶液B 中檢測(cè)到的內(nèi)毒素的濃度減去溶液A中檢測(cè)到的內(nèi)毒素的濃度計(jì)算得到的內(nèi)毒素回收率，其結(jié)果在50-200%的范圍內(nèi)。

 

當(dāng)內(nèi)毒素的回收率超出規(guī)定的范圍，則認(rèn)為供試品溶液存在干擾因素。用稀釋倍數(shù)更大（不超過(guò)MVD）的溶液重新試驗(yàn)。此外，不超過(guò)MVD的供試品溶液或稀釋后供試品的溶液中存在的干擾可以通過(guò)適當(dāng)?shù)尿?yàn)證過(guò)的處理方式來(lái)消除，列如過(guò)濾、中和、分離、加熱等方式。為了確認(rèn)所采用的處理方式能有效的消除干擾且不會(huì)導(dǎo)致內(nèi)毒素減少，用加入標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素且已按照既定的處理方式處理后的供試品溶液按照上述規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)。