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我國的干細胞藥物研發(fā)已迎來黃金時代，截至2024年5月初，我國已有59家企業(yè)，共計114款干細胞藥物臨床試驗申請獲得受理，其中50家企業(yè)，共計91款產(chǎn)品獲得臨床試驗?zāi)驹S可。

干細胞產(chǎn)品，由于其“活”的藥品屬性，其CMC開發(fā)難點較多，也是其成藥最核心的挑戰(zhàn)?；诖耍贗CH-Q8中最先提出質(zhì)量源于設(shè)計（Quality by Design，QbD）這一理念，這一系統(tǒng)的研發(fā)方法，在基于可靠的科學(xué)和質(zhì)量風(fēng)險管理基礎(chǔ)之上，從預(yù)先確定的產(chǎn)品目標(biāo)出發(fā)，強調(diào)對產(chǎn)品和工藝的理解以及工藝控制。ICH-Q8強調(diào)，藥品質(zhì)量是通過設(shè)計所賦予的。區(qū)別于事后控制的質(zhì)量源于檢驗（Quality by Testing，QbT），和事中控制的質(zhì)量源于生產(chǎn)（Quality by production，QbP）。

QbD可分為以下6個關(guān)鍵步驟。

1、預(yù)先設(shè)定目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量概況（Quality Target Product Profile，QTPP）；

 

2、基于風(fēng)險分析，確立產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attributes，CQAs）；

 

3、通過風(fēng)險評估（Risk Assessment）和實驗設(shè)計（Design of Experiment，DoE），確定關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）、關(guān)鍵物料屬性（CMA）和CQA的關(guān)系；

 

4、在多種影響因素下，建立能滿足產(chǎn)品性能和工藝穩(wěn)健的設(shè)計空間（Design Space），量化參數(shù)的可變性對CQA的影響。

 

5、根據(jù)設(shè)計空間，建立質(zhì)量風(fēng)險管理（Quality Risk Management，QRM），確立控制策略（Control Strategy，CS）和形成工藝控制空間。

 

6、生產(chǎn)后，實施檢測和控制，持續(xù)改進工藝，保證工藝的穩(wěn)健性和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。

本文將按照QbD的這六個關(guān)鍵步驟順序，介紹QbD在干細胞產(chǎn)品研發(fā)中的應(yīng)用及相關(guān)案例。

 

Step 1：確定MSC的QTPP

QTPP是藥品開發(fā)的基礎(chǔ)，是滿足藥物制劑安全性、有效性的質(zhì)量特征，缺乏明確定義的QTPP會造成生產(chǎn)資源的極大浪費。藥品的QTPP主要包括：

1、預(yù)期的臨床用途，給藥途徑、劑型設(shè)計、給藥系統(tǒng)與處方組成；

 

2、藥物的劑量與規(guī)格

 

3、藥品的有效期

 

4、藥品包裝容器密閉系統(tǒng)

 

5、藥物釋放和藥代動力學(xué)的屬性

 

6、藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

下述表格以MSC產(chǎn)品舉例，羅列出了在MSC產(chǎn)品開發(fā)中的QTPP：

表1、MSC產(chǎn)品的QTPP

 

Step 2：識別MSC產(chǎn)品的CQA

ICH-Q8是這樣定義產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性的：物理、化學(xué)、生物或者微生物性能或特征在適當(dāng)?shù)南薅取⒎秶蚍植?，以確保得到期望的產(chǎn)品質(zhì)量。MSC產(chǎn)品的CQA，即能夠保證MSC的安全性和有效性的質(zhì)量屬性。在確定CQA時，通常使用風(fēng)險排序法（PRM）：通過評估質(zhì)量屬性對安全性和有效性的風(fēng)險來確定CQA。評估包含兩個維度：嚴重度和不確定性。其中，計算風(fēng)險分數(shù)可使用嚴重度和不確定性相乘的數(shù)值。

嚴重度評分可分為三檔：1）嚴重度較低，定義數(shù)值為1，這類屬性的可變性對產(chǎn)品的安全性或有效性的影響很小或忽略不計，對患者的不良影響輕微且短暫。2）嚴重度中等，定義數(shù)值為3，即產(chǎn)品在臨床歷史中，屬性的變異性可能降低安全性或有效性?？赡軐?dǎo)致可控制的不良反應(yīng)，但不大可能對患者產(chǎn)生重大影響。3）嚴重度高，數(shù)值為10，這類屬性的變異性可能對患者產(chǎn)生潛在的嚴重影響。對安全性、有效性存在潛在的重大變化，可能導(dǎo)致嚴重的不良反應(yīng)。

對不確定性的評分也分為三檔：1）不確定性低，數(shù)值定義為1，這類質(zhì)量屬性在大量的文獻中已有報道，基于廣泛的臨床前研究、臨床研究經(jīng)驗。2）不確定性中等，數(shù)值定義為2，即同類產(chǎn)品有部分文獻報道，有一些可用的體內(nèi)、體外或臨床的數(shù)據(jù)，在臨床方面只有有限的使用該產(chǎn)品的臨床經(jīng)驗。3）不確定性高，數(shù)值定義為3，針對這類產(chǎn)品，先驗知識很有限，在臨床前和臨床研究中均沒有此產(chǎn)品可用的數(shù)據(jù)。

計算風(fēng)險分數(shù)時，可將“嚴重度”和“不確定性”相乘，風(fēng)險等級得分范圍為：1-2分為非CQA；3-9分為pCQA；10-30分為CQA。

針對MSC產(chǎn)品，下表展示了部分通過RPM識別出的CQA項。

表2、MSC產(chǎn)品的CQA及判定依據(jù)

 

Step 3：識別MSC產(chǎn)品的關(guān)鍵物料屬性CMA

在工藝流程中，當(dāng)前一工序的輸出物料成為下一工序的輸入物料時，輸出物料的CQA可能變成輸入物料的CMA，因此在工藝流程中的關(guān)鍵物料，除了原始物料和輔料外，還包括中間體。識別MSC產(chǎn)品的CMA時，首先需確定全部物料屬性，從對產(chǎn)品的安全性和有效性兩方面評估其對產(chǎn)品CQA的影響；同時評估供應(yīng)鏈風(fēng)險，包括供應(yīng)商質(zhì)控、產(chǎn)品供應(yīng)的連續(xù)性和物料變更可能。

針對MSC產(chǎn)品的開發(fā)過程中，關(guān)鍵的物料屬性如下：

表3、MSC產(chǎn)品的CMA及判定依據(jù)

藥典中還劃定了四類物料的風(fēng)險。

1）第1級為低風(fēng)險、高品質(zhì)的材料，是獲得許可的生物制品、批準(zhǔn)的藥物、批準(zhǔn)或承認的醫(yī)療設(shè)備，或者旨在用作植入的生物材料。通常為無菌包裝系統(tǒng)或無菌劑型包裝的，如人血清白蛋白、生理鹽水等。

2）第2級為低風(fēng)險、表征良好的材料，預(yù)期用途是用于藥物、生物制品或醫(yī)療器械生產(chǎn)，高闊細胞、基因和組織工程產(chǎn)品的物料，是在GMP條件下生產(chǎn)的，如GMP級別的培養(yǎng)基、凍存液、細胞因子等。

3）第3級為中等風(fēng)險材料，通常這些材料是為科學(xué)研究或體外診斷用途而生產(chǎn)的，而非用于生產(chǎn)細胞產(chǎn)品。這類材料可能需要升級物料的生產(chǎn)工藝以允許可使用該物料生產(chǎn)細胞產(chǎn)品，例如升級的科研級細胞因子生產(chǎn)工藝。

4）第4級為高風(fēng)險材料，這些材料不是用于細胞產(chǎn)品的生產(chǎn)，也非cGMP生產(chǎn)的。包含具有已知生物學(xué)作用機制的劇毒物質(zhì)，或未經(jīng)外源病毒去除或滅活的復(fù)雜動物源材料，例如胎牛血清、胰蛋白酶等。

 

Step 4：對MSC工藝中CPP的識別

ICH-Q8中定義了關(guān)鍵工藝參數(shù)，即其波動會影響到產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，而應(yīng)該被監(jiān)測或控制的工藝參數(shù)，以確保能夠生產(chǎn)出預(yù)期質(zhì)量的產(chǎn)品。

以臍帶源間充質(zhì)干細胞的生產(chǎn)工藝為例，不同階段的CPP有很多。例如：在臍帶采集時，作為原材料臍帶的運輸溫度和運輸時間；原代分離階段的組織塊大小、接種密度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基種類；細胞擴增階段的培養(yǎng)基種類、接種密度、培養(yǎng)溫度、溶氧、pH值、葡萄糖濃度、培養(yǎng)時間、細胞匯合度等；細胞建庫階段的消化時間、離心轉(zhuǎn)速、離心時間、東村密度、凍存液組分、程序降溫和存儲溫度等；原液生產(chǎn)階段的解凍時間、復(fù)滲時間、洗滌次數(shù)、離心力、離心時間、溶媒組分、細胞密度等；制劑灌裝階段的灌裝速度、灌裝體積、細胞濃度、保存溫度和保存時間。

圖4、MSC生產(chǎn)工藝[1]

針對MSC產(chǎn)品的的CPP判定依據(jù)如下表：

圖5、MSC產(chǎn)品的CPP及判定依據(jù)

 

Step 5：使用DoE設(shè)計，建立設(shè)計空間

設(shè)計空間的定義為：已被證明能保證產(chǎn)品質(zhì)量的輸入變量（如物料屬性CMA）和關(guān)鍵工藝參數(shù)CPP的多為組合交互作用的范圍，在設(shè)計空間內(nèi)的更改不需要上報，因為其不屬于變更。

例如在一篇通過DoE設(shè)計優(yōu)化間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基組分的專利中[]提到，可以使用minitab軟件，按照選擇變量因子→設(shè)計不同水平，確定影響因子水平→列出全因子試驗設(shè)計表→按照DoE給出方案進行MSC培養(yǎng)基優(yōu)化實驗→主效應(yīng)及交互作用分析→實現(xiàn)最優(yōu)化。

在這篇專利中，發(fā)明人將間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基種類（培養(yǎng)基中有或無血清），QDS（一種啟動水）體積含量，QDY（一種啟動水）體積含量作為三個關(guān)鍵因子，設(shè)置不同水平進行交互分析。

圖5、主效應(yīng)分析圖，表明無血清培養(yǎng)基效果高于有血清，啟動水QDS和QDY的含量分別為5%時，培養(yǎng)效果最佳。

圖6、交互作用分析圖，確定MSC培養(yǎng)基的最佳優(yōu)化條件為：無血清培養(yǎng)基，5%體積啟動水QDS， 5%體積啟動水QDY。

 

Step 6：持續(xù)工藝改進

間充質(zhì)干細胞產(chǎn)品其持續(xù)的工藝改進至關(guān)重要。研究人員不斷探索和升級培養(yǎng)基配方、優(yōu)化細胞培養(yǎng)環(huán)境或者擴大生產(chǎn)規(guī)模，從而提高細胞分離、擴增甚至相關(guān)的生物學(xué)性能。有些平臺也基于基因改造等升級了二代間充質(zhì)干細胞產(chǎn)品，或是采用3D培養(yǎng)條件擴大了產(chǎn)能。隨著技術(shù)革新與持續(xù)的工藝改進，工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量檢測的結(jié)果等都會造成工藝變更。為了正確評估并實施相關(guān)工藝變更，應(yīng)當(dāng)建立一個有效的變更管理系統(tǒng)。下表中列舉了關(guān)于MSC產(chǎn)品中的一些變更案例。

圖7、MSC產(chǎn)品變更類型及判定依據(jù)

實施QbD理念并應(yīng)用到產(chǎn)品開發(fā)中，將有助于提高產(chǎn)品開發(fā)效率和創(chuàng)新性。通過系統(tǒng)分析潛在影響因素和優(yōu)化工藝參數(shù)，藥品開發(fā)人員將更快地篩選出最佳工藝方案，從安全性和有效性這兩大方面，保證產(chǎn)品質(zhì)量，加速間充質(zhì)干細胞產(chǎn)品從研發(fā)到上市的進程。

1、Optimization of Mesenchymal Stromal Cell (MSC) Manufacturing Processes for a Better Therapeutic Outcome，F(xiàn)ront. Immunol., 09 June 2022.

 

2、專利授權(quán)號CN 114317423 B.

 

3、ICH Q8.