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嘉峪檢測網(wǎng) 2024-06-11 17:10
有機磷類農(nóng)藥(OPs)是目前應用最廣泛的農(nóng)藥之一，主要包括對硫磷、樂果、內(nèi)吸磷、馬拉硫磷、敵百蟲及敵敵畏等。OPs的應用非常廣泛，存在于食物、空氣、土壤、水體等中。OPs通過食物鏈進入人體后，會導致人體健康受損。長期接觸低劑量OPs會對人體的心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等造成不同程度的影響，甚至導致腫瘤的發(fā)生。人體生物監(jiān)測可精確測量經(jīng)不同暴露途徑進入人體內(nèi)的環(huán)境化合物總量，進而對人體組織和體液內(nèi)(血、尿、母乳等)環(huán)境化學物質及其代謝物進行分析，從而獲取個體及群體暴露環(huán)境化學物質的類別、數(shù)量、負荷水平、變化趨勢及早期健康效應等數(shù)據(jù)。我國于2017年開展了第一輪國家人體生物監(jiān)測項目，目前第二輪國家人體生物監(jiān)測項目已開啟，OPs是該項目的重要組成部分。以上工作說明，監(jiān)測人體生物樣本中OPs暴露水平具有重大的公共衛(wèi)生意義。因此，本文綜述了檢測人體生物樣本中 OPs的常用前處理及檢測方法，可為監(jiān)測 OPs及其代謝產(chǎn)物在人體生物樣本中含量、了解和綜合評價農(nóng)藥的人群暴露劑量及對健康的影響提供方法學參考。
1、OPs理化性質和人體內(nèi)代謝過程
1.1 理化性質與分類
OPs大多呈油狀或結晶狀，工業(yè)品呈淡黃色至棕色，除敵百蟲和敵敵畏之外，大多具有蒜臭味，一般不溶于水，易溶于苯、丙酮、乙醚、三氯甲烷等有機溶劑，對光、熱、氧均較穩(wěn)定,遇堿易分解破壞。敵百蟲為白色結晶，能溶于水，遇堿可轉變?yōu)槎拘暂^大的敵敵畏。市場上銷售的OPs劑型主要有乳化劑、可濕性粉劑、顆粒劑和粉劑四大劑型。
1.2 人體內(nèi)代謝過程
OPs通過消化道、皮膚及呼吸道等途徑進入人體內(nèi)后，可迅速分布于全身臟器并在肝內(nèi)代謝，代謝方式主要為水解作用和氧化作用。大多OPs結構相似，進入體內(nèi)后通常被代謝為6種二烷基磷酸鹽(DAPs)中的一種或幾種，包括磷酸二甲酯(DMP)、磷酸二乙酯(DEP)、二甲基硫代磷酸酯(DMTP)、二乙基硫代磷酸酯(DETP)、二甲基二硫代磷酸酯 (DMDTP)和二乙基二硫代磷酸酯(DEDTP)，并在暴露后的6~24h內(nèi)通過尿液排出。除上述DAPs外，OPs還會產(chǎn)生特殊代謝產(chǎn)物，特殊代謝產(chǎn)物通常對應一種或少數(shù)幾種OPs，具有特異性。如馬拉硫磷二羥基酸是馬拉硫磷的特殊代謝產(chǎn)物，3,5,6-三氯-2-吡啶醇(3,5,6-TCP)是毒死蜱、甲基毒死蜱的特殊代謝產(chǎn)物等。文獻常報道的一些OPs特殊代謝產(chǎn)物如表1所示。
表1 OPs的特殊代謝產(chǎn)物
2、生物樣本的選擇
尿液是監(jiān)測人體OPs暴露最常用的生物樣本，優(yōu)點為樣本易于收集，缺點是無法通過尿液中的代謝物推斷出特定母體農(nóng)藥的信息。通過檢測血液或血液制品可以直接監(jiān)測血液中的OPs母體化合物，而不是代謝物。但是，血液樣本不易收集，樣本量有限且血液中農(nóng)藥濃度水平低，對分析技術的靈敏度要求更高。除了常用的尿液、血液樣本外，其他樣本如胎糞、臍帶血、羊水等也在暴露評估中起著重要作用。胎糞可反映妊娠16周到分娩前的污染物長期累計暴露水平，是胎兒宮內(nèi)暴露評估的良好基質。臍帶血可以不用靜脈穿刺即可得到相對較大的樣本量 (>30mL)。與胎糞只能檢測妊娠期第16周到分娩這段時間的嬰兒暴露劑量相比，測量羊水(妊娠12~20周期間)可以了解胎兒早期暴露情況。其他可用于暴露評估的生物樣本如唾液、頭發(fā)等在人體OPs生物監(jiān)測與暴露評估研究中報道較少。
3、生物樣本的前處理方法
合適的前處理方法不僅可以有效提取農(nóng)藥，減少或消除生物樣本中基質成分的干擾，而且可以提高檢測方法靈敏度。生物樣本中OPs的前處理技術發(fā)展迅速，目前常用的方法有液液萃取法(LLE)、 固相萃取法(SPE)、QuEChERS等。
3.1 液液萃取法
LLE的優(yōu)點是簡單快速、經(jīng)濟易行、技術成熟、應用范圍廣，不需要復雜的設備，是最經(jīng)典的前處理方法之一。常用的萃取溶劑主要有乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、丙酮等。但是，LLE是一種非選擇性方法，生物樣本中的脂質、糖類等干擾物質也會隨OPs被共萃取，需采取進一步措施去除萃取液中的脂質，如冷凍離心、吸附色譜、凝膠滲透色譜等。同時，LLE需要的有機溶劑用量較大，溶劑揮發(fā)會對操作者產(chǎn)生一定毒害。
周志榮等在進行LLE 時，比較了乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮3種常見萃取溶劑的提取效率，并選取乙酸乙酯萃取血清中8種OPs。陳雁君等用丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯等溶劑萃取人血清中的樂果，以氣相色譜-質譜法(GC-MS)測定，經(jīng)比較，丙酮毒性較低，且所得OPs回收率高。DULAURENT等選取乙酸乙酯為萃取溶劑重復提取尿液中6種DAPs。LLE在生物樣品OPs檢測中的應用如表2所示。
表2 LLE在生物樣本OPs檢測中的應用
3.2 固相萃取法
SPE具有溶劑用量少、提取效率高、可實現(xiàn)自動化批量處理等的優(yōu)點，是常用的生物樣本前處理方法之一。SPE柱的常見填料有C18、Oasis HLB等。柳潔等以Oasis HLB柱萃取，乙酸乙酯洗脫時，血樣凈化效果和其中25種OPs的回收率最好。馮翠玲等采用C18 柱萃取，氣相色譜法(GC)測定血漿中4種OPs含量。黃夢瑩等分別考察了親水親油平衡(Waters Oasis HLB)柱、弱陽離子交換(Waters Oasis WCX)柱及弱陰離子交換(Waters Oasis WAX)柱對尿液中4種OPs代謝物的萃取效果以及含體積分數(shù)10%，20%，30%甲酸的甲醇溶液和含10%甲酸的乙腈溶液的洗脫效果，并選取Waters Oasis WCX柱和含10%甲酸的甲醇溶液進行試驗。DE ALWIS 等以苯乙烯-二乙烯基苯(SDVB)聚合物為吸附劑，建立了全自動、高效率凈化尿液的方法，該方法可實現(xiàn)人尿液中的6種DAPs的重復測定。SPE在生物樣品OPs檢測中的應用如表3所示。
表3 SPE在生物樣本OPs檢測中的應用
3.3 QuEChERS
QuEChERS是近年來發(fā)展起來的一種快速前處理方法，與傳統(tǒng)前處理方法相比，該方法具有操作簡單、成本低廉等優(yōu)點。QuEChERS基本包括提取和凈化兩個步驟，兼具固-液萃取(SLE)和分散固相萃取(d-SPE)的優(yōu)勢。洪萍等建立了一種同時測定中毒者血樣中4種 OPs的快速檢測方法，在處理血液樣品時應用了QuEChERS，取得了滿意的結果。QuEChERS在生物樣品OPs檢測中的應用如表4所示。
表4 QuEChERS在生物樣本OPs檢測中的應用
3.4 其他前處理方法
除上述常用方法外,還有一些前處理方法，如固相微萃取法(SPME)、液液微萃取法(LLME)、微波萃取法(MAE)、加速溶劑萃取法(ASE)以及 LLE、SPE、QuEChERS的聯(lián)用方法，亦取得不錯效果。
FIŠEROVÁ 等將樣品溶液過HLB柱后，收集流出液進行QuEChERS凈化，用于提取尿樣中5種DAPs和5種特殊代謝產(chǎn)物。其他前處理方法在生物樣本OPs檢測中的應用如表5所示。
表5 其他前處理方法在生物樣本OPs檢測中的應用
4、生物樣本的檢測方法
4.1 氣相色譜法
GC是目前測定OPs殘留量的經(jīng)典手段之一，常用FPD和NPD來檢測OPs。
馮翠玲等采用GC-FPD分析實際中毒病人血漿中4種OPs，檢出限為 5~10μg·L-1，該方法操作簡便、結果可靠，靈敏度高，可為臨床中毒病人的急救提供可靠的依據(jù)。WU等采用GC-FPD檢測上海地區(qū)90名受試者120份尿液樣本中的6種DAPs，所得回收率高、檢出限低。將該方法用于評估非職業(yè)性和職業(yè)性人群的OPs暴露水平，獲得上 海地區(qū)針對OPs項目的首份生物監(jiān)測報告。TARBAH等采用GC-NPD對尿液、血漿、血清和食物多種樣本中23種 OPs進行定量分析。LEE等采用SPME提取人體全血和尿液中的9種OPs，并采用GC-NPD檢測。PITARCH等采用GC-NPD同時測定尿液和血清樣品中10種常見OPs的含量。
4.2 氣相色譜-質譜法
GC只依靠色譜的保留時間進行定性，定性能力有限，而質譜檢測器(MS具有定性能力強的優(yōu)勢。GC-MS是定性定量分析痕量化合物的重要手段，廣泛應用于復雜多組分的分離鑒定。
柳潔等用SPE-GC-MS建立了一種同時檢測中毒血樣中25種OPs的方法，檢出限為20~30μg·L-1。LACASSIE 等提出了一種高效、特異性強、靈敏度高的同時測定血液和血清中29種OPs含量的方法，檢出限為5~25μg·L-1，且方法回收率、精密度和準確度良好。
4.3 氣相色譜-串聯(lián)質譜法
GC-MS/MS可選擇特定的母離子進行二次質譜分析，有效地排除了樣本中其他物質的干擾，靈敏度更高、抗干擾能力更強，有更強的定性能力，更適合分析生物樣本中的痕量農(nóng)藥。周志榮等采用GC-MS/MS測定血清中敵敵畏、對 硫磷、氧化樂果等16種OPs的含量，除敵敵畏外，其他OPs的檢出限均低于2μg·L-1。BRAVO等構建了測定約1100份孕婦和兒童尿液樣本中6種DAPs含量的GC-MS/MS，檢出限為0.1~0.6μg·L-1，該檢測方法可用于一般人群研究。
4.4 液相色譜-串聯(lián)質譜法
LC可以有效的分離和檢測熱不穩(wěn)定性、高分子以及高沸點的化合物。但是，采用LC定性未知化合物時，必須通過已知標準物質定性，若無標準對照，則需借助質譜、化學分析、紅外光譜等輔助定性。目前，應用于生物樣本中OPs檢測的方法主要為LC-MS/MS。
DULAURENT等采用LC-MS/MS 同時定量分析6種DAPs，結果顯示，LC-MS/MS可用來監(jiān)測一般人群接觸OPs的水平。王賢親等采用LC-MS/MS檢測人血漿中5種OPs，檢出限為0.21~2.71μg·L-1。張成龍等采用QuEChERS提取和凈化血液樣本后，采用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道離子阱高分辨質譜法(UPLC-Q Exactive Orbitrap HRMS)同時檢測血液中13種OPs代謝產(chǎn)物，13種OPs代謝產(chǎn)物標準曲線線性關系良好，檢出限為0.2~10μg·L-1。
5、結語
1)針對生物樣本中OPs的分析，如果目的是追溯人體暴露于具體哪種 OPs(如中毒事件原因排查)，則應選擇血液樣本；如果目的是監(jiān)測正常人群日常生活中暴露于OPs的總負荷，則尿液樣本更具優(yōu)勢。
2)在生物樣本中OPs檢測種類方面，本文涉及的文獻累計報道了75種 OPs以及16種OPs代謝產(chǎn)物，單篇文獻報道的農(nóng)藥種類最少為1種，最多為29種，其中大部分文獻在OPs檢測種類的選擇上無依據(jù)的標準。國家標準GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了564種農(nóng)藥殘留限量，包括我國批準登記農(nóng)藥428種、禁限用農(nóng)藥49種以及我國禁用農(nóng)藥以外的尚未登記農(nóng)藥87種。建議相關研究選擇檢測農(nóng)藥種類時可以參考 GB 2763—2021，比如在分析血液樣本時，以49種禁限用農(nóng)藥為待測對象。GBZ/T 300.149—2017《工作場所空氣有毒物質測定 第149部分：殺螟松、倍硫磷、亞胺硫磷和甲基對硫磷》、GBZ/T 300.150-2017《工作場所空氣有毒物質測定第150部分：敵敵畏、甲拌磷和對硫磷》、GB/T 300.151—2017《工作場所空氣有毒物質測定 第151部分：久效磷、氧樂果和異稻瘟凈》、GB/T 300.153—2017《工作場所空氣有毒物質測定 第153部分：磷胺、內(nèi)吸磷、甲基內(nèi)吸磷和馬拉硫磷》規(guī)定了工作場所空氣中14種OPs的測定方法，但沒有規(guī)定OPs環(huán)境暴露時血液樣本的分析方法，建議在此后工作中進行補充和完善。
3)高效的樣品前處理方法是獲得準確檢測結果的關鍵。樣品前處理方法主要有LLE、SPE、SPME、QuEChERS等。其中，LLE和SPE都是經(jīng)典且常用的前處理方法，技術成熟，但LLE缺少凈化步驟，且需要使用大量有機溶劑，對人體危害較大；SPE 是一種主流的前處理技術，雖然凈化效果較好，但存在時間耗費長等問題；SPME所得OPs的回收率較低；QuEChERS是一種較新的前處理技術，憑借其快速、簡單、可靠、安全等特點而發(fā)展迅速，GB 23200.113—2018《植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質譜聯(lián)用法》首次把QuEChERS引入到國家食品安全標準中，該方法是未來監(jiān)測生物樣本農(nóng)藥殘留的發(fā)展方向及趨勢。
4)檢測方法主要有GC、GC-MS、GC-MS/MS、LC-MS/MS等。GC在定性定量分析的準確度上存在一定的局限性；GC-MS具有高靈敏、高選擇、高抗干擾的優(yōu)點，但MS定性能力不及MS/MS；GC-MS/MS具有更高的靈敏度，非常適合痕量農(nóng)藥的定性定量檢測，且能有效消除假陽性現(xiàn)象；LC-MS/MS的應用范圍更廣，適用于GC-MS/MS不適用的高沸點農(nóng)藥的檢測。
5)檢出限可以綜合反映方法的靈敏度與精密度。檢出限越低，意味著該方法靈敏度越高，精密度越好，是評價儀器性能及分析方法的重要技術指標。OPs代謝快，蓄積性弱，普通人體液內(nèi)的農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的含量很小，這要求檢出限需達到痕量水平。以樂果為例，LLE所得的平均檢出限為5.11μg·L-1，SPE所得的平均檢出限為9.57μg·L-1，QuEChERS所得的平均檢出限為20μg·L-1；GC 所得的平均檢出限為9μg·L-1，GC-MS所得的平均檢出限為15μg·L-1，LC-MS/MS所得的平均檢出限為0.21μg·L-1，說明不同前處理方法和檢測方法等皆會影響OPs檢出水平。但是，這些已報道方法存在基質干擾大、試驗成本高、部分OPs代謝物檢出限偏高等問題，建議后續(xù)在構建相關檢測方法時應盡可能提高方法的靈敏度。
監(jiān)測OPs環(huán)境暴露與人體健康關系的研究依賴于檢測技術的發(fā)展，因此開發(fā)操作簡便、分析快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、多種農(nóng)藥同時檢測的前處理與檢測方法是相關研究的重要方向。
作者：陳玉婕1，劉華良1，2，張昊2，盧宇劍1
單位：1.南京醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院；
2.江蘇省疾病預防與控制中心 理化檢驗所
來源：《理化檢驗-化學分冊》2024年第4期
來源：理化檢驗化學分冊
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