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很多無菌醫(yī)療器械產(chǎn)品在放行過程中會對產(chǎn)品的無菌性進(jìn)行控制，在檢查要點指南里也指出，作為無菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)，其無菌檢驗工作應(yīng)由本企業(yè)獨立完成，因此在產(chǎn)品技術(shù)要求制定過程中要考慮產(chǎn)品無菌檢查的方法是否符合產(chǎn)品的控制要求，所采用的無菌檢查方法應(yīng)適合于該產(chǎn)品的無菌檢查，能夠給出正確的結(jié)果。

醫(yī)療器械的無菌檢查方法適用性試驗一般依據(jù)《中國藥典》2020年四部通則1101“無菌檢查法”、GB/T14233-2008《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第2部分：生物學(xué)試驗方法》以及北京市醫(yī)療器械無菌檢驗檢查要點指南（2023版）進(jìn)行開展。若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗。下面分享一個敷料產(chǎn)品的無菌方法適應(yīng)性試驗案例和大家一起共同探討方法建立的過程。

1、設(shè)備及器具：

集菌儀、培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、生物安全柜、電子天平等。

平皿、燒杯、三角瓶、輸液瓶及配套瓶塞、接種環(huán)、集菌培養(yǎng)器、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、一次性注射器等。

2、稀釋液及沖洗液：

稀釋液pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

3、試驗用菌株名稱和編號：

以上菌株由中國藥品生物制品檢定所提供。

4、菌液制備

①取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1ml，加入至9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，10倍稀釋至10-9約為不大于100cfu/ml的菌懸液，備用。

②取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h的大腸埃希菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物1ml，加入至9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，10倍稀釋至10-7約為不大于100cfu/ml的菌懸液，備用。

③取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h的枯草芽孢桿菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物1ml，加入至9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，10倍稀釋至10-7約為不大于100cfu/ml的菌懸液，備用。

④取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h生孢梭菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)物1ml，加入至9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，10倍稀釋至10-6約為不大于100cfu/ml的菌懸液，備用。

⑤取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)2～3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)物1ml，加入至9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，10倍稀釋至10-7約為不大于100cfu/ml的菌懸液，備用。

⑥取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)5～7天獲得豐富孢子的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)物，加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。用管口帶有薄的無菌棉花的無菌注射器吸取1ml，加入至9ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，10倍稀釋至10-5約為不大于100cfu/ml的孢子懸液，備用，計數(shù)結(jié)果見下表。

菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在2～8℃可在24小時內(nèi)使用，黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用，本實驗所有菌懸液均為當(dāng)天使用。

5、供試液的制備及處理

取供試品10個，每個剪取約9cm2至燒杯中，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液200ml（每9cm2樣品加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液20ml），振搖使其全部浸泡，37℃水浴浸提1小時，取全部浸提液作為供試液，按《中國藥典》2020版四部通則1101“無菌檢查法”檢查，采用薄膜過濾法，過濾3個濾筒，每濾筒沖洗3次，每次100ml，沖洗液為pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。在最后一次沖洗液中分別加入不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌，加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)。白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌按同法操作，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)。

陰性對照：以pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液和供試品，接入規(guī)定量培養(yǎng)基，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。

陽性對照：取一裝有同體積的培養(yǎng)基的容器加入等量試驗菌，作為陽性對照，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。

樣品管及對照管培養(yǎng)記錄見下表。

6、結(jié)果判斷：陰性對照無菌生長，與對照管比較，含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢查可行。

7、結(jié)論評價

根據(jù)上述驗證試驗結(jié)果表明，采用薄膜過濾法，所有試驗菌株均能在實驗組、陽性對照組中生長良好，并且與陽性對照組比較，所有試驗菌株在產(chǎn)品實驗組中出現(xiàn)生長的時間均無明顯差異。產(chǎn)品該檢驗量在該檢驗方法下無抑菌作用。因此該敷料產(chǎn)品的無菌檢查依據(jù)《中國藥典》2020版無菌檢查法中的薄膜過濾法進(jìn)行檢驗。每濾筒沖洗3次，每次100ml，沖洗液為pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，陽性對照菌選用金黃色葡萄球菌。