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細菌內(nèi)毒素，進入血液或腦脊液時會引起發(fā)熱，因此，又稱為“熱原”，它是革蘭氏陰性菌細胞壁上的特有結(jié)構(gòu)，細菌在存活狀態(tài)時不釋放出來，只有當細菌死亡自溶時才釋放到細胞外，表現(xiàn)多種毒性作用，為區(qū)別于外毒素而稱之為內(nèi)毒素。細菌內(nèi)毒素作為外源性致熱原，極微量即可對人體健康產(chǎn)生嚴重影響，能引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素血癥、內(nèi)毒素休克和彌散性血管內(nèi)凝血等，嚴重者會造成死亡。因此，對生物制品進行內(nèi)毒素檢測至關重要。

 

檢測方法

 

1、凝膠法

 

凝膠法是通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的原理進行半定量檢測內(nèi)毒素的方法。此檢測方法雖為內(nèi)毒素檢測的標準方法，但檢測范圍存在一定的局限性，且對檢測用水和檢測條件均存在一定的要求。

 

2、光度測量法

 

光度法（包括濁度法和顯色法）可定量檢測內(nèi)毒素的含量，其中濁度法是通過內(nèi)毒素與鱟試劑的C因子產(chǎn)生反應，由此激活的凝固酶會切斷凝固蛋白原中的精氨酸肽鏈，形成凝膠狀蛋白；而顯色基質(zhì)法是通過測定內(nèi)毒素與鱟試劑反應時產(chǎn)生的凝固酶使某種特殊底物釋放出來的生色團的量，來檢測內(nèi)毒素含量的鱟試驗法。

 

定量檢測的數(shù)據(jù)不僅有利于追蹤產(chǎn)品質(zhì)量趨勢，還能起到風險預警的作用，達到數(shù)據(jù)完整性的要求。

 

內(nèi)毒素檢測的影響因素

 

試驗條件與操作：培養(yǎng)條件、操作環(huán)境可能引起各次實驗之間、各實驗室之間的結(jié)果差異。

 

1、時間

 

鱟試劑在液態(tài)時不穩(wěn)定，室溫放置太久會影響反應靈敏度，加樣結(jié)束后，應立即放入恒溫水浴中，延長保溫時間，可提高LAL的靈敏度。5分鐘混合點的活性最強，混合時間越長，活性反而降低，但在三十分鐘以內(nèi)的各混合時間點測定的靈敏度均在規(guī)定范圍內(nèi)。在顯色法中靈敏度與時間有關，實驗中既要嚴格控制每個環(huán)節(jié)的保溫時間，又要嚴格控制終止時間。

 

2、溫度

 

凝膠試驗規(guī)定的孵化溫度為37℃，實驗證明，保溫在25-41℃，隨著溫度的升高，LAL的靈敏度也隨著升高，在41-46℃之間，對靈敏度無明顯影響；≥48℃會破壞鱟試劑。

 

3、pH值

 

鱟試劑的pH作用區(qū)間是6-8之間，7.0-7.5最佳。

 

4、試驗耗材

 

內(nèi)毒素稀釋不宜用注射器，應使用經(jīng)過校正的刻度吸管。且針栓膠塞容易吸附內(nèi)毒素而使其濃度不夠，造成凝膠反應不成立。

 

5、操作程序

 

加樣次序可能會出現(xiàn)實驗結(jié)果不成立等問題。

 

6、處理作用

 

不同產(chǎn)品處理和儲存條件可能為出現(xiàn)分析的誤差，鱟試劑溶解后的保存條件等。

 

供試品

 

1、多糖

 

β-葡聚糖可以激活G因子使得結(jié)果呈陽性。實驗室常用的酒精、棉球等含有較多的葡聚糖，低于一定濃度的葡聚糖或LAL-RM（反應物）不足以使鱟試劑的凝集反應產(chǎn)生陽性，但如果有細菌內(nèi)毒素共同作用的情況下，凝集反應會變得更為激烈和迅速，很容易使反應出現(xiàn)陽性結(jié)果。

 

2、蛋白

 

〖陽離子蛋白〗：溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G能夠與細菌內(nèi)毒素形成細菌內(nèi)毒素-蛋白復合體，對細菌內(nèi)毒素有顯著的屏蔽作用，從而影響用鱟法來測定內(nèi)毒素。在測定之前使用蛋白酶K來消化樣品，可使細菌內(nèi)毒素的回收率達到百分之百。

 

〖血紅蛋白〗：人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活G因子。研究表明使用一般鱟試劑測定人血白蛋白、球蛋白等血液制品的陽性檢出率明顯高于用去G因子LAL測定的陽性率，而后者與兔熱原檢查結(jié)果基本一致。

 

〖免疫蛋白〗：免疫球蛋白可以激活G因子途徑。

 

3、離子

 

離子強度較大會引起內(nèi)毒素的聚集，加重低濃度內(nèi)毒素不易分散的問題；另外LAL中的C因子必須在二價陽離子的參與下才能被激活形成活化的C因子。研究發(fā)現(xiàn)鎂離子增強了LAL顯色反應，鈣離子濃度大于5mmol/L時抑制反應。當溶液中含有EDTA等絡合劑或抗凝劑時，陽性離子會失去作用，也就會影響測定。

 

4、有機鹽

 

核酸鈉能像內(nèi)毒素一樣被檢出，出現(xiàn)假陽性干擾。

 

5、透析液

 

鱟試劑測定透析液中的內(nèi)毒素方法待進一步考察。

 

6、中藥成分

 

清熱解毒類藥物等能夠干擾LAL試驗。

 

7、生化藥品

 

氨基酸對鱟試劑有較強的抑制作用。

 

8、其它物質(zhì)

 

多種凝血因子、蛋白質(zhì)變性物質(zhì)、高糖溶液、絡合物、電解質(zhì)、維生素、添加劑等都會干擾鱟試劑形成凝膠。

 

9、鱟試劑內(nèi)源性因子

 

試劑盒內(nèi)部因子干擾。

 

10、試劑質(zhì)量

 

批次、溶解水、靈敏度等。

 

檢測趨勢

 

隨著鱟資源的逐漸減少和重組技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外出現(xiàn)了幾種新興的細菌內(nèi)毒素檢測方法，主要有兩種：

 

1、微量凝膠法或微量顯色法，仍然采用鱟試劑，但用量僅為原來的八分之一或更少。

 

2、重組C因子法。重組C因子是一種人工合成的C因子，它可被細菌內(nèi)毒素活化后，與熒光底物作用產(chǎn)生于內(nèi)毒素濃度呈量化關系的熒光信號。

 

生物制品中內(nèi)毒素的來源主要有：菌毒種、生產(chǎn)環(huán)境、不規(guī)范操作、設備及器械、原輔材料等。對于生物制品生產(chǎn)中內(nèi)毒素污染的控制最主要的措施是生產(chǎn)過程控制，即嚴格按GMP要求進行生產(chǎn)，嚴格無菌操作，防止內(nèi)毒素產(chǎn)生。