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嘉峪檢測網(wǎng) 2024-06-20 08:47
摘要
生物制品的質(zhì)量控制是其藥學(xué)研究和評價的關(guān)鍵，貫穿藥品的整個生命周期。隨著生物制品相關(guān)分析技術(shù)的發(fā)展和上市后產(chǎn)品知識的積累，上市許可持有人(marketing authorization holder，MAH)可持續(xù)改進(jìn)藥物分析方法，增強(qiáng)質(zhì)量風(fēng)險管理。本文從監(jiān)管角度出發(fā)，探討關(guān)于治療用生物制品分析方法變更的審評考量，分享分析方法變更的相關(guān)案例，為制藥企業(yè)持續(xù)不斷提升藥物質(zhì)量控制和完善分析方法變更申報資料提供參考。
關(guān)鍵詞：治療用生物制品；分析方法；全生命周期管理；上市后藥學(xué)變更
生物制品的質(zhì)量控制是其藥學(xué)研究和評價的關(guān)鍵內(nèi)容，貫穿藥物的全生命周期管理。在開發(fā)期間研究者需要根據(jù)臨床安全性、有效性、免疫原性和藥動學(xué)影響對藥物質(zhì)量屬性進(jìn)行評估，以確定其是否為關(guān)鍵質(zhì)量屬性，針對關(guān)鍵質(zhì)量屬性建立相應(yīng)的控制策略，選擇特定檢測項目的分析方法,并對檢測結(jié)果制定合理的可接受范圍[1-2]。分析方法作為質(zhì)量控制的重要組成部分，決定了質(zhì)量控制體系的可靠性和準(zhǔn)確性。
分析方法的開發(fā)、驗證、轉(zhuǎn)移、變更和日常監(jiān)測是連續(xù)且相互關(guān)聯(lián)的，貫穿了產(chǎn)品生命周期管理的始終，不斷推動著產(chǎn)品質(zhì)量朝著更優(yōu)的方向發(fā)展[3-4]。藥物早期的研發(fā)、臨床試驗申請和注冊過程往往經(jīng)歷分析方法的開發(fā)、建立、確認(rèn)、驗證、轉(zhuǎn)移、再驗證等過程，從而確保分析方法適用于藥物的過程中控制、放行檢測和穩(wěn)定性檢測[5]。在獲批上市后,一方面上市許可持有人(marketing authorization holder,MAH)需要對生產(chǎn)工藝進(jìn)行持續(xù)驗證，不斷積累商業(yè)化生產(chǎn)的研究數(shù)據(jù)；另一方面，隨著更加先進(jìn)和靈敏的分析技術(shù)的出現(xiàn)和成熟運用，MAH 利用這些新技術(shù)持續(xù)改進(jìn)藥物分析方法，采用更優(yōu)的分析技術(shù)以增強(qiáng)產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險管理能力[6]。應(yīng)用新的質(zhì)量控制分析方法，往往具有降低檢驗成本、提高方法穩(wěn)健性、加快產(chǎn)品放行、減少實驗動物使用等方面的優(yōu)勢。
本文將從監(jiān)管角度出發(fā)，探討生物制品分析方法變更的相關(guān)案例，為MAH 持續(xù)不斷提升藥品質(zhì)量控制和完善上市后變更申報資料提供參考。
一、研究流程和一般策略
ICH Q8，Q9，Q10 和 Q11 等指導(dǎo)原則描述了用于藥物開發(fā)的質(zhì)量源于設(shè)計(quality by design，QbD)理念、方法和工具以及全生命周期的質(zhì)量體系要求[6-8]。隨著 QbD 在藥物開發(fā)中的應(yīng)用越來越廣泛，已擴(kuò)展到包括分析方法生命周期在內(nèi)的分析方法開發(fā)和維護(hù)中。在分析質(zhì)量源于設(shè)計(analyti-cal quality by design，AQbD)框架下，MAH 應(yīng)充分利用專業(yè)知識和生產(chǎn)經(jīng)驗，積極運用風(fēng)險評估和風(fēng)險管理工具，開展持續(xù)的監(jiān)測和驗證，從而獲得符合預(yù)期性能要求的質(zhì)量可靠的分析方法[9]。基于科學(xué)的風(fēng)險評估和全面的變更研究是分析方法生命周期內(nèi)迭代更新的基礎(chǔ)。
MAH 在進(jìn)行分析方法的迭代更新研究時，可以參考相關(guān)的國內(nèi)外技術(shù)指南，例如國家藥品監(jiān)督管理局的《已上市生物制品藥學(xué)變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》、ICH Q12 的“藥品生命周期管理的技術(shù)和監(jiān)管考慮”、ICH Q14 的“分析方法開發(fā)(草案)等[10-11]。
生物制品分析方法的迭代變更與產(chǎn)品質(zhì)量控制密切相關(guān)，由 MAH 對分析方法的變更進(jìn)行風(fēng)險評估，確定風(fēng)險等級。MAH 可以參考《已上市生物制品藥學(xué)變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》，同時結(jié)合分析方法特點和實際變更內(nèi)容展開風(fēng)險評估，根據(jù)風(fēng)險等級執(zhí)行變更研究，按照藥品注冊管理的規(guī)定及程序申報補(bǔ)充申請、備案或報告。變更執(zhí)行后，MAH 仍需持續(xù)對分析方法的性能進(jìn)行監(jiān)測，收集產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)信息。分析方法變更研究流程示例見圖1。
▲圖1-分析方法變更研究流程示意圖
1.1 變更理由和依據(jù)
分析方法在產(chǎn)品生命周期內(nèi)的迭代更新應(yīng)朝著更加準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)健、快捷的目標(biāo)努力，從而保證質(zhì)量控制體系的先進(jìn)性和可靠性。MAH應(yīng)在申報資料中提供變更分析方法的理由和依據(jù)。通常導(dǎo)致分析方法更新的理由可能包括企業(yè)自身因素和外部因素。企業(yè)因素包括提高方法性能、降低檢驗成本、易于操作、加快產(chǎn)品放行、解決供應(yīng)鏈問題等，或由于對產(chǎn)品的質(zhì)量屬性有更深人全面的認(rèn)識而提出更多分析要求(如抗體中的痕量序列變異體[12]）。外部因素包括《中華人民共和國藥典》分析方法的升級或為了符合《中華人民共和國藥典》各論要求、上市后批件遺留問題要求、生物類似藥對應(yīng)的參照藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或分析方法升級、實驗動物倫理壓力等。
1.2 風(fēng)險評估
MAH 應(yīng)根據(jù)分析方法迭代更新的具體事項、可能后果和不確定性對預(yù)期變更進(jìn)行風(fēng)險評估，需要考慮的因素通常包括待檢測質(zhì)量屬性的等級、技術(shù)復(fù)雜性和變更程度等。
1.2.1 質(zhì)量屬性等級
不同質(zhì)量屬性對于產(chǎn)品質(zhì)量和療效的影響類型和影響程度需要結(jié)合潛在臨床影響(有效性、安全性、藥動學(xué)和免疫原性)進(jìn)行進(jìn)一步風(fēng)險評估。MAH 可以通過運用不同的風(fēng)險評估工具，根據(jù)產(chǎn)品特定的研究、同類產(chǎn)品/平臺經(jīng)驗外部文獻(xiàn)知識確定質(zhì)量屬性等級。通常情況下，某一質(zhì)量屬性的等級越高，則用于控制該質(zhì)量屬性的分析方法變更的風(fēng)險等級越高。
1.2.2 技術(shù)復(fù)雜性
基于動物、細(xì)胞和免疫化學(xué)的活性分析方法與理化分析方法相比,技術(shù)復(fù)雜性更高、潛在影響因素更多，因而變更風(fēng)險等級更高。重組蛋白類產(chǎn)品的電荷變異體通常色譜圖的組分峰復(fù)雜，某些峰間分離度較差，需要根據(jù)酸堿組分進(jìn)行合并報告，風(fēng)險等級較高。外觀(顏色、澄清度)和鑒別項目屬于定性的分析方法，如采用藥典方法或成熟的技術(shù)時，與其他用于質(zhì)量控制的定量分析方法相比技術(shù)復(fù)雜性較低。
1.2.3 變更程度
分析方法在整個生命周期內(nèi)均可能發(fā)生變更，變更可能為同一分析方法內(nèi)的參數(shù)微調(diào)和修改，或者完全替換成新的分析方法。耐用性研究中經(jīng)驗證的參數(shù)變更時，或僅在相同分析方法內(nèi)進(jìn)行一個或者多個參數(shù)的微調(diào)時，風(fēng)險等級較低。藥典方法是經(jīng)過充分證明、技術(shù)成熟且廣泛應(yīng)用的分析方法，當(dāng)將藥典中同一檢項下的一個檢測方法變?yōu)榱硪粋€檢測方法，或者由企業(yè)內(nèi)部分析方法變?yōu)樗幍浞椒〞r，通常風(fēng)險等級較低，但仍需要進(jìn)行研究和評估。某一檢測方法從藥典方法變?yōu)榉撬幍浞椒〞r，需要謹(jǐn)慎并進(jìn)行全面合理的研究與評估。新技術(shù)更迭如果涉及分析方法原理變更，由于先驗知識和使用經(jīng)驗的缺乏，在應(yīng)用初期存在一些不確定性，風(fēng)險等級較高。
1.3 變更研究策略
MAH 在確定分析方法變更的風(fēng)險等級后，可參考相關(guān)法規(guī)和指導(dǎo)原則制定變更研究策略，開展相關(guān)研究。分析方法的迭代更新可以從以下方面開展研究：對新方法進(jìn)行全面的方法學(xué)驗證；采用變更前后的分析方法對代表性樣品進(jìn)行比對分析，從而確定變更前后分析方法的等效性；根據(jù)等效性研究結(jié)果評估原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測項目的可接受范圍是否適用于更新的分析方法；如不再適用,需要重新擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的擬定可以參考相關(guān)文獻(xiàn)、ICH Q6B 和《中華人民共和國藥典》要求[1,6]。MAH 需要提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定依據(jù)及擬定過程，證明質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的合理性。ICH Q14“分析方法開發(fā)(草案)提出了一種分析方法變更評價的示例，見表1。
▲表1-ICH Q14 分析方法變更評價示例
二、案例分析
2.1 純度分析方法
生物制品具有復(fù)雜的高級結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾和糖基化修飾，同時在貯存中容易發(fā)生聚集和降解，產(chǎn)生分子大小異構(gòu)體和電荷異構(gòu)體[13]。這些變體的存在可能對產(chǎn)品生物學(xué)活性、免疫原性及體內(nèi)代謝產(chǎn)生影響，通常需要采用多種分析手段對生物制品的純度進(jìn)行控制。隨著分析檢測技術(shù)手段的升級，越來越多重現(xiàn)性好、靈敏度高、自動化程度高的分析方法用于替代傳統(tǒng)分析方法，應(yīng)用于藥物的質(zhì)量控制，例如采用毛細(xì)管凝膠電泳(capillary electrophore-sis-sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)替代還原/非還原十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳( sodiumdodeeyl sulfate-polyacrylamide gel eleetrophoresis , SDS-PAGE)控制藥物的分子大小異構(gòu)體；采用成像毛細(xì)管等電聚焦(imaged capillary isoelectric focusing,iCIEF)毛細(xì)管等電聚焦電泳(capillary isoelectricfocusing，cIEF)替換定性的等電聚焦(isoelectric fo-cusing,EF)控制藥物的電荷異構(gòu)體[14-15]。
當(dāng)與純度相關(guān)的分析檢測技術(shù)手段發(fā)生升級時，通常需要對新方法進(jìn)行完整的方法學(xué)驗證，同時對新舊方法的關(guān)鍵方法學(xué)性參數(shù)(如精密度、準(zhǔn)確度、檢測限)進(jìn)行比較,新方法的靈敏度應(yīng)不低于舊方法。在此案例中，某企業(yè)原本采用 IEF 凝膠分析聯(lián)用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行原液和成品的放行與穩(wěn)定性檢測，以控制電荷異質(zhì)性,但該產(chǎn)品電荷異質(zhì)體組分復(fù)雜，不能準(zhǔn)確定量；擬采用較新的cEF平臺技術(shù)替代半定量IEF，以便更為準(zhǔn)確地定量測量電荷異構(gòu)體。研究者進(jìn)行了方法學(xué)驗證，包括專屬性準(zhǔn)確度、重復(fù)性、中間精密度、線性、范圍、定量限、檢測限、耐用性,并考察了方法的穩(wěn)定性指示作用。cIEF 峰檢測限為 0.3%，相比之下變更前 IEF 凝膠中條帶的檢測限為1%，擬定分析方法實現(xiàn)了定量檢測，靈敏度更高。
研究者需要將現(xiàn)行方法與擬定方法比較，同步采用現(xiàn)行方法和擬定方法分析一定批次的代表性樣品，從而確定變更前后分析方法的等效性。純度和異構(gòu)體檢測項目通常具有穩(wěn)定性指示意義，研究者可采用新舊分析方法對穩(wěn)定性留樣或強(qiáng)制破壞樣品進(jìn)行同步分析。此外，由于擬定分析方法可能對產(chǎn)品異構(gòu)體的分離能力更好，研究者還應(yīng)對新分析方法檢測出的異構(gòu)體組分峰或新的雜質(zhì)峰進(jìn)行分離鑒定和表征研究[16-17]。在此案例中，研究者分離不同的電荷異構(gòu)體組分峰后，采用液質(zhì)聯(lián)用的方法表征蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和糖類結(jié)構(gòu)，對富集的電荷異構(gòu)體進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和生物學(xué)活性檢測，結(jié)果證明電荷異質(zhì)性與C末端賴氨酸含量變化、天冬酰胺脫酰胺化和唾液酸修飾有關(guān)。
在此案例中，先前的原液和制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度范圍不再適用于新的分析方法，研究者可根據(jù)代表性原液和制劑的放行數(shù)據(jù)、長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)和分析方法的變異性擬定變更后檢測方法的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。研究者采用了68個原液批次(包括凍存留樣和商業(yè)化批次)確立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分別計算了歷史12個批次和當(dāng)前 48 個批次的主峰、酸性峰和堿峰的均值±3SD 區(qū)間，擬定了原液放行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍。申請人應(yīng)根據(jù)實際申報的具體情況(如質(zhì)量屬性特點、工藝能力、臨床試驗相關(guān)性等)選擇合適的統(tǒng)計學(xué)方法。在制定成品的放行和貨架期標(biāo)準(zhǔn)時還需要考慮制劑生產(chǎn)和貯存過程中發(fā)生的電荷異構(gòu)體變化。審評機(jī)構(gòu)將根據(jù)變更風(fēng)險要求申請人基于更新的檢定方法及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與中國食品藥品檢定研究院接洽單項復(fù)核檢定事宜。
綜上，通過對代表性批次樣品的分析和全面的方法學(xué)驗證，研究者證明新方法的靈敏度和分離度有顯著提高且具有穩(wěn)定性指示意義，并對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度范圍的適用性進(jìn)行了重新評估，從而保證了質(zhì)量控制體系的先進(jìn)性和可靠性。
2.2 工藝相關(guān)雜質(zhì)分析方法
生物制品的工藝相關(guān)雜質(zhì)通常來源于細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)或下游工藝，包括宿主細(xì)胞蛋白( hostcell protein，HCP)、宿主細(xì)胞殘留 DNA、細(xì)菌內(nèi)毒素、色譜配基、工藝添加物等。工藝相關(guān)雜質(zhì)應(yīng)盡可能在下游純化工藝中去除，以保障患者安全。風(fēng)險等級較高的工藝相關(guān)雜質(zhì)通常作為常規(guī)監(jiān)測納入原液放行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。殘留 HCP 具有潛在的免疫原性風(fēng)險，還可導(dǎo)致蛋白聚集、降低最終產(chǎn)品的質(zhì)量，影響制劑和處方的穩(wěn)定性[18]。作為工藝相關(guān)雜質(zhì)的控制重點，下文將對 HCP 殘留量分析方法的變更研究進(jìn)行探討。
生物制品的 HCP 殘留量通常采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)進(jìn)行定量檢測。ELISA 包被板中的多克隆抗HCP抗體決定了測定法的靈敏度和 HCP 覆蓋率。在產(chǎn)品開發(fā)初期，研究者通常采用商業(yè)化試劑盒進(jìn)行HCP 殘留量的檢測。進(jìn)入關(guān)鍵性臨床階段以后，研究者將自行開發(fā)基于專屬產(chǎn)品和特定工藝的ELISA分析方法。研究者可采用基于凝膠的分析方法(如2D-PAGE/2D-Western blot)或液質(zhì)聯(lián)用( liquid chro-matography-mass spectrometry,LC-MS)分析方法完成新舊方法 HCP 覆蓋率的檢測。關(guān)于擬定方法應(yīng)達(dá)到的最小 HCP 覆蓋率，目前監(jiān)管機(jī)構(gòu)尚未有明確共識，但新分析方法的 HCP 覆蓋率理論上不應(yīng)低于原分析方法。
例如，某企業(yè)申請采用新開發(fā)的多克隆抗CHOHCP 家免抗體代替原有的山羊抗體進(jìn)行EISA 分析，從而實現(xiàn)更好的免疫應(yīng)答。變更試劑盒抗體來源后，試劑盒對較低分子量和堿性殘留蛋白的檢出效率更高，采用 CHO HCP 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對比研究，原抗體檢測覆蓋率約68%，擬定方法抗體檢測蓋率約95%。申報資料對95個歷史批次分別采用變更前后的檢定方法檢定 HCP，結(jié)果顯示相同批次產(chǎn)品的 HCP 水平整體升高，超出原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)限度。本品僅進(jìn)行了 HCP 試劑盒更新，生產(chǎn)工藝等其他方面均未發(fā)生變更，產(chǎn)品質(zhì)量無實質(zhì)變化，更新的檢測試劑盒 HCP 覆蓋率提高，申請人自檢結(jié)果與中國食品藥品檢定研究院檢定結(jié)果差異較小，基于充分的變更研究和風(fēng)險評估，認(rèn)為修訂該技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)具有較好的科學(xué)基礎(chǔ)。需要關(guān)注的是，在分析方法變更的同時如伴隨其他變更，不能判斷產(chǎn)品質(zhì)量是否發(fā)生變化時，放寬 HCP 雜質(zhì)殘留限度有可能增加患者的安全性風(fēng)險，研究者需要結(jié)合人體暴露量、臨床免疫原性和安全性數(shù)據(jù)、殘留 HCP 的種類和風(fēng)險等充分評估放寬 HCP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度的合理性。
當(dāng)前生物制品殘留 HCP含量的控制依然基于可檢測的宿主殘留蛋白總量。考慮到不同產(chǎn)品的純化工藝對 HCP 的清除能力不同，且各種 HCP 的分子大小、結(jié)構(gòu)、可檢測性和安全性風(fēng)險存在差異如何使新型 HCP 分析方法和控制手段應(yīng)用于產(chǎn)品質(zhì)量控制，實現(xiàn)更精準(zhǔn)的基于風(fēng)險的控制，有待監(jiān)管機(jī)構(gòu)和工業(yè)界共同探討。近年來，基于LC/MS 的HCP 檢測方法在鑒別和定量的性能上逐漸超越了常規(guī)免疫測定法。LC/MS分析方法可實現(xiàn)不同HCP的分離鑒定和分別定量，從而更好地針對其安全性風(fēng)險實施控制，在考察下游純化工藝對 HCP 的清除研究以及 HCP 覆蓋率研究中都具有巨大的應(yīng)用潛力[19-22] 。當(dāng) ELISA 方法檢測到總 HCP 水平升高或其他異常的分析檢測情況時，可采用替代方法對個別潛在高風(fēng)險 HCP 進(jìn)行針對性的監(jiān)測。例如，某些特定 HCP 具有降解制劑中關(guān)鍵輔料聚山梨酯80的酶活性,從而影響制劑穩(wěn)定性；可以開發(fā)基于酶活性的檢測方法對特定 HCP 進(jìn)行監(jiān)測和控制。此外，研發(fā)機(jī)構(gòu)在必要時可采用分離的高風(fēng)險雜質(zhì)開展進(jìn)一步的免疫原性評估和毒理學(xué)研究，甚至從工程細(xì)胞構(gòu)建的源頭敲除高風(fēng)險 HCP 相關(guān)基因。
2.3 活性分析方法
生物學(xué)活性是產(chǎn)品有效性的評估手段，是產(chǎn)品最關(guān)鍵的質(zhì)量屬性之一。生物制品的生物學(xué)活性測定應(yīng)盡可能反映產(chǎn)品的作用機(jī)制。生物學(xué)活性的分析方法可用于定性鑒別，也可用于定量檢測。結(jié)合不同制品的作用機(jī)制差異，研發(fā)機(jī)構(gòu)可開發(fā)體內(nèi)動物分析、細(xì)胞活性、結(jié)合活性等多種活性檢測手段，目前胰島素類產(chǎn)品已經(jīng)可以用色譜法替代動物法但是一些激素類產(chǎn)品(如生長激素、促卵泡激素等)被《中華人民共和國藥典》收錄的生物學(xué)活性仍均基于實驗動物，如小鼠、大鼠或家免等[23]。從體內(nèi)生物測定法變更到體外生物測定法或理化分析法可減少使用實驗室動物，符合國際實驗動物 3R 原則即reduction(減少)、replacement(替代)、refinement(優(yōu)化)[24-25]。研究者應(yīng)說明用體外活性方法替代動物法的科學(xué)性和合理性，充分證明2種方法的相關(guān)性及體外活性測定方法的可行性。在具有充分依據(jù)的情況下，研究者可以申請用細(xì)胞活性分析方法替代基于動物的分析方法。
替代性的體外活性測定可以根據(jù)不同產(chǎn)品的作用機(jī)制開發(fā)，例如通過測試目的蛋白與膜受體結(jié)合的效率，或者通過測量目的蛋白刺激培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)酶或輔助信使的能力來實現(xiàn)。報告基因法是待測生物制品的刺激反應(yīng)元件或作用靶標(biāo)和熒光素酶基因共同轉(zhuǎn)染生物學(xué)活性測定細(xì)胞，當(dāng)樣品與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活反應(yīng)原件，導(dǎo)致熒光素酶的表達(dá)激活或抑制，從而在體外可使用光度計進(jìn)行定量檢測。某企業(yè)申請用葡萄糖-6-磷酸酶熒光素酶啟動子系統(tǒng)代替家免實驗檢測胰島素的生物學(xué)活性。研究者評估了方法的線性、重復(fù)性、中間精密度、準(zhǔn)確度、范圍、樣品/標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性和專屬性,結(jié)果滿足驗收標(biāo)準(zhǔn)。如果測得的胰島素活性為不低于 15 U·mg-1，則認(rèn)為按照美國藥典(USPharmacopeia,USP)生物鑒別方法進(jìn)行的檢測符合要求。細(xì)胞受體檢測方法通過與公司參考標(biāo)準(zhǔn)品比較測定了某個樣品的相對效價百分比。研究者進(jìn)行了方法學(xué)比對研究，結(jié)果表明在家免實驗中生物鑒別呈陽性的9個批次(2個原料藥生產(chǎn)廠生產(chǎn)的批次)在細(xì)胞受體檢測中也呈陽性。監(jiān)管方認(rèn)為變更前后方法學(xué)比對研究的批次和數(shù)據(jù)有限，建議在初期采用2種分析方法并行進(jìn)行原料藥的生物活性分析，積累足夠的放行檢測數(shù)據(jù)并充分評估2種分析方法的相關(guān)性。此外，研究者需要關(guān)注變更后原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是否依然適用。體內(nèi)法通常為定性檢測，而細(xì)胞分析方法作為可量化的指標(biāo)，其標(biāo)準(zhǔn)限度應(yīng)設(shè)定上限和下限。
2.4 快速微生物檢測方法
無菌檢測是生物制品放行檢測中的常規(guī)安全性檢測項目，通常根據(jù)《中華人民共和國藥典》2020 年版通則 1101 無菌檢查法檢測,以確保產(chǎn)品無微生物污染。傳統(tǒng)的微生物檢測方法需要14d的培養(yǎng)時間，由分析人員目視檢查。對于細(xì)胞治療等短效期的產(chǎn)品和用于流行病防控的新型疫苗產(chǎn)品，長達(dá)2周的微生物檢測時間可能成為制約產(chǎn)品放行和用于患者的限制因素。制藥行業(yè)在過去多年間，不斷致力于開發(fā)新型可替代的快速微生物檢驗技術(shù)。采用快速微生物檢測技術(shù)替代傳統(tǒng)微生物檢測手段具有眾多優(yōu)勢：可加快產(chǎn)品放行、降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)在線監(jiān)控、保證數(shù)據(jù)完整性，同時對生產(chǎn)中的潛在污染更快響應(yīng)。
目前應(yīng)用較廣泛的快速微生物檢測技術(shù)主要基于培養(yǎng)微生物獲取信號、直接測量微生物或分析細(xì)胞成分原理。常見的快速無菌檢測系統(tǒng)有 MilliflexCelsis Advanc,BacT/Alert,Bactec 等。Celsis 檢測系統(tǒng)和 Milliflex 檢測系統(tǒng)均基于 ATP 生物發(fā)光成像系統(tǒng)，BacT/Alert 檢測系統(tǒng)和 Bactec 檢測系統(tǒng)基于對代謝產(chǎn)物CO,的檢測。不同快速微生物檢測系統(tǒng)的分析檢測時間、測試能力、檢測限存在差異[26-28]。
《中華人民共和國藥典》、美國藥典和歐洲藥典均收錄了微生物檢驗替代方法驗證的相關(guān)指導(dǎo)原則，研究者可以根據(jù)微生物檢驗方法的定性或定量差異，開展替代方法的方法學(xué)驗證。微生物檢驗替代方法的驗證可參考《中華人民共和國藥典》2020年版三部“藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則”開展。無菌檢查法的替代驗證屬于定性檢查應(yīng)至少考察快速檢驗分析方法的專屬性、檢測限、重現(xiàn)性和耐用性。微生物限度檢驗的替代驗證屬于定量檢查，應(yīng)考察快速檢驗方法的準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、定量限、線性、范圍、重現(xiàn)性、耐用性。研究者還需要開展方法適用性研究，考察制劑是否存在生長抑制或產(chǎn)品干擾。研究者應(yīng)證明替代方法與藥典分析方法之間的等效性。等效性研究是一種比較試驗，要求使用相同范圍的微生物平行運行2 種方法。根據(jù)2種方法所產(chǎn)生數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理來證明替代方法結(jié)果等效或優(yōu)于(不劣于)藥典方法。如果替代方法產(chǎn)生的結(jié)果優(yōu)于或等效藥典方法，則認(rèn)為替代無菌檢查的性能等效?？焖贌o菌檢驗替代方法的驗證總結(jié)示例見表2。
▲表2-快速無菌檢驗替代方法的驗證總結(jié)示例
微生物檢驗替代方法的方法學(xué)驗證和等效性研究所涉及菌株至少應(yīng)包含微生物限度檢查和無菌檢查法規(guī)定的藥典菌株，還應(yīng)根據(jù)替代方法及樣品特點增加相應(yīng)的菌株?！吨腥A人民共和國藥典》中無菌檢查法的實驗菌株包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白念珠菌、黑曲霉；非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查(微生物計數(shù)法)的實驗菌株包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉。此外，研究者可根據(jù)產(chǎn)品特點增加一些環(huán)境常見菌、生長緩慢并難以檢測的菌株、對患者高風(fēng)險的菌株和挑戰(zhàn)微生物(如饑餓或應(yīng)激菌株)。研究者應(yīng)在申報資料中充分評估微生物種類和選擇的合理性，例如，某公司在申請同步采用藥典方法和替代方法用于產(chǎn)品放行的變更時，未納人2種《中華人民共和國藥典》2020 年版要求的實驗菌株，審評機(jī)構(gòu)建議其進(jìn)行相關(guān)補(bǔ)充研究或就未納人相關(guān)實驗菌株的合理性予以解釋。
考慮到傳統(tǒng)的微生物檢測方法已應(yīng)用多年，監(jiān)管方可能建議在應(yīng)用替代分析方法的初期，同步采用藥典分析方法和替代分析方法進(jìn)行放行檢測，從而積累足夠批次的數(shù)據(jù)作為支持。當(dāng)然，快速替代微生物檢測方法也存在一些缺點，例如資金投入高單一供應(yīng)商、難以檢測生長緩慢的菌株或某些特定菌株等。為充分保障用藥者的安全,建議申請人根據(jù)替代方法的局限性制訂風(fēng)險應(yīng)對措施和質(zhì)量控制策略。
三、討論
分析方法的生命周期管理將在執(zhí)行變更后持續(xù)進(jìn)行[29]。研究者需要在日常運行中對更新的方法進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測和定期評估，從而確認(rèn)分析方法的性能符合預(yù)期，促進(jìn)分析方法的持續(xù)改進(jìn)[30]。持續(xù)性監(jiān)測、工藝驗證并積累商業(yè)化數(shù)據(jù)后，研究者還應(yīng)對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可接受范圍的合理性進(jìn)一步評估[31]。
分析方法在產(chǎn)品生命周期內(nèi)的迭代更新應(yīng)保證質(zhì)量控制體系的先進(jìn)性和可靠性[7]。MAH 應(yīng)基于科學(xué)和風(fēng)險的基礎(chǔ)開展支持性研究，用充分的數(shù)據(jù)和邏輯支持變更。在分析方法發(fā)生變更的同時，如果生產(chǎn)物料和生產(chǎn)工藝沒有發(fā)生變化，那么產(chǎn)品質(zhì)量、安全性和有效性并不會發(fā)生實質(zhì)性變化，更新后的分析方法將更有利于反映產(chǎn)品質(zhì)量的真實狀況，降低檢測能力限制帶來的不確定性，識別質(zhì)量屬性出現(xiàn)異常的情況。
平臺分析方法的上市后變更面臨著多個產(chǎn)品的同步實施。通常情況下,當(dāng)待測樣品的結(jié)構(gòu)和屬性相近的情況下，用于檢測不同產(chǎn)品的平臺方法的操作條件、系統(tǒng)適用性和報告方式不會發(fā)生顯著變化。當(dāng)執(zhí)行變更的風(fēng)險對于類似多個產(chǎn)品相同或相似時，MAH應(yīng)根據(jù)風(fēng)險進(jìn)行備案或申報，同類品種已獲準(zhǔn)的變更信息可作為平臺分析方法的支持性數(shù)據(jù)，同時還應(yīng)開展產(chǎn)品針對性的分析方法研究。
對于在多個國家獲批上市的產(chǎn)品，往往面臨著全球監(jiān)管策略的差異和復(fù)雜性，MAH 在執(zhí)行變更時需要充分了解各個國家/地區(qū)監(jiān)管要求的差異，合理布局和規(guī)劃在各個批準(zhǔn)國家/地區(qū)的申報策略。
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來源：中國新藥雜志
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