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前言：

在醫(yī)藥領(lǐng)域，對(duì)于藥物純度的管控非常嚴(yán)格，雜質(zhì)的管理貫穿于整個(gè)藥物的生命周期。結(jié)晶是藥物分離過程中的一個(gè)重要單元操作，結(jié)晶一開始主要是重結(jié)晶，本質(zhì)上是為了控制藥物產(chǎn)品純度，即通過結(jié)晶工藝不僅僅可以控制產(chǎn)品的晶型、粒度、晶習(xí)等指標(biāo)，也可以得到期望的產(chǎn)品純度。本文通過梳理文獻(xiàn)并結(jié)合經(jīng)驗(yàn)，將不同雜質(zhì)殘留機(jī)理粗分為三類，對(duì)應(yīng)闡述不同類別雜質(zhì)的結(jié)晶除雜策略。

 

1、 雜質(zhì)殘留機(jī)理的分類

文獻(xiàn)中，對(duì)于結(jié)晶過程中雜質(zhì)殘留在晶體中的機(jī)理有充分的研究。主要機(jī)理有：表面吸附、母液殘留、晶體間的團(tuán)聚包裹、溶液包藏、晶體缺陷嵌套、共沉淀、共晶/固體溶液。根據(jù)企業(yè)中解決實(shí)際項(xiàng)目的經(jīng)驗(yàn)。從工業(yè)應(yīng)用的角度，我們將機(jī)理粗分為如下三大類：排除情況、簡(jiǎn)單情況、復(fù)雜情況。

 

2、 排除情況

排除情況代表，實(shí)際工業(yè)項(xiàng)目中幾乎沒有因?yàn)檫@類API-雜質(zhì)作用方式，導(dǎo)致藥物雜質(zhì)超標(biāo)，從而困擾企業(yè)研發(fā)人員的。包括表面吸附雜質(zhì)殘留機(jī)理和母液殘留機(jī)理。

圖1 雜質(zhì)表面吸附示意圖

表面吸附：雜質(zhì)小分子吸附在晶體表面，從而導(dǎo)致藥物產(chǎn)品的雜質(zhì)超標(biāo)。實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中，不可能出現(xiàn)此類情況。為什么呢？從數(shù)量級(jí)上去分析： 藥物晶體尺寸  10-100um，假想為立方體，表面積為0.01-0.1um2/um3，而典型的有機(jī)小分子的尺寸在10A左右，所有晶體表面都吸附滿雜質(zhì)小分子的話，雜質(zhì)含量計(jì)算下來，最多也就接近0.001-0.01vol%。這個(gè)量是非常低的，甚至低于藥企中HPLC檢測(cè)下限。加之，晶體表面不是平的，不同的晶面暴露的官能團(tuán)不一樣  對(duì)雜質(zhì)的吸附能力也不一樣，不存在“雜質(zhì)分子”吸附滿所有晶體表面的情形，也就是說，實(shí)際情況只會(huì)比0.01vol%更少。

圖2 母液殘留示意圖

溶液殘留：母液中溶解的雜質(zhì)，通過干燥溶劑揮發(fā)后，雜質(zhì)保留在藥物產(chǎn)品中。實(shí)際項(xiàng)目中，很少有因?yàn)槿芤簹埩魴C(jī)理出現(xiàn)雜質(zhì)超標(biāo)，困擾除雜的情況出現(xiàn)。理由是：只有晶體細(xì)小過濾困難情形下，固液分離時(shí)才會(huì)截留大量的母液，就算是這種比較差的情況，通過多次洗滌液置換，也很容易控制雜質(zhì)水平。

 

3、簡(jiǎn)單情況

簡(jiǎn)單情況，代表是受結(jié)晶“動(dòng)力學(xué)控制”的雜質(zhì)殘留機(jī)理，是可以在現(xiàn)有結(jié)晶工藝基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化結(jié)晶工藝來解決雜質(zhì)超標(biāo)問題。其包括的雜質(zhì)殘留機(jī)理有（圖3所示）：晶體間的團(tuán)聚包裹雜質(zhì)、晶體內(nèi)溶液包藏導(dǎo)致雜質(zhì)殘留、晶體缺陷嵌套雜質(zhì)晶體或者分子。

圖3 簡(jiǎn)單情況雜質(zhì)殘留機(jī)理示意圖

3.1 簡(jiǎn)單情況的識(shí)別

方法一:現(xiàn)象法

晶體的聚集，在偏光顯微鏡（PLM）下，可以非常直觀的觀察到；

溶液在晶體間的包藏，會(huì)出現(xiàn)多種雜質(zhì)均呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，同時(shí)產(chǎn)品會(huì)伴隨出現(xiàn)溶殘超標(biāo)的情況。

晶體生長(zhǎng)過快導(dǎo)致的表面或內(nèi)部雜質(zhì)嵌套，會(huì)觀察到XRD結(jié)晶度的明降低，或者在結(jié)晶過程中，觀察到不同攪拌速度下，產(chǎn)品純度存在明顯差異。

方法二：逐步溶解實(shí)驗(yàn)法

實(shí)驗(yàn)方法：1，測(cè)試API的溶解度；2，將能完全溶解API的溶劑分為5-10份，逐步加入雜質(zhì)超標(biāo)的產(chǎn)品中，取樣測(cè)試雜質(zhì)含量變化趨勢(shì)；3，作圖，比對(duì)后，判斷雜質(zhì)殘留類型。

圖4 逐步溶解實(shí)驗(yàn)示意圖

圖4是逐步溶解實(shí)驗(yàn)判斷雜質(zhì)情況分類，如果逐步加入溶劑過程中，雜質(zhì)完全溶解完，只有20%-80%的API溶解，則可以判斷雜質(zhì)殘留機(jī)理是受動(dòng)力學(xué)控制的簡(jiǎn)單情況。

3.2 簡(jiǎn)單情況結(jié)晶除雜的策略

動(dòng)力學(xué)因素產(chǎn)生的雜質(zhì)超標(biāo)的應(yīng)對(duì)策略：降低析晶速率，改善流體力學(xué)-攪拌-粒子間相互的碰撞（這個(gè)時(shí)候可以考慮攪拌形式和攪拌速度的影響）、優(yōu)化過飽和度曲線（降溫速率，滴加速率，加晶種，減少動(dòng)力學(xué)包藏）、循環(huán)升降溫等。

 

4、復(fù)雜情況

復(fù)雜情況，主要指除雜的上限受“熱力學(xué)控制”的雜質(zhì)殘留機(jī)理，是需要綜合考慮結(jié)晶熱力學(xué)和結(jié)晶動(dòng)力學(xué)的影響的情形。復(fù)雜情況的除雜：結(jié)晶動(dòng)力學(xué)調(diào)整會(huì)有作用，但熱力學(xué)問題決定除雜的上限。復(fù)雜情況是除雜中最難的，也是項(xiàng)目中資源、時(shí)間精力投入最多的一類情況。先直觀看一下，來自真實(shí)工業(yè)應(yīng)用中的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)：

圖5勃林格殷格翰和默克公司統(tǒng)計(jì)的難除雜機(jī)理歸類

圖5表格中統(tǒng)計(jì)了32組2017-2022 期間，真實(shí)工業(yè)應(yīng)用中難除雜的product-impurity組合，其中21組來自勃林格殷格翰，11組來自默克公司。發(fā)現(xiàn)困擾藥企研發(fā)人員的雜質(zhì)處理問題，均屬于除雜中的復(fù)雜情況，主要分為兩大類：第一類是API和雜質(zhì)形成共沉淀，這個(gè)更多涉及的是熱力學(xué)溶解度問題；第二類是API-雜質(zhì)形成“固體溶液”，主要涉及固相混溶問題。

圖6 復(fù)雜情況殘留機(jī)理示意圖

圖6是復(fù)雜除雜情況中，雜質(zhì)殘留機(jī)理示意圖，包括API和雜質(zhì)形成共沉淀、API和雜質(zhì)形成固體溶液、API和雜質(zhì)形成共晶三類情況。這里特別強(qiáng)調(diào)下，API 和雜質(zhì)形成共晶的情形是特例，更多的涉及的在對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的管理，有專門的對(duì)映異構(gòu)體結(jié)晶拆分控制異構(gòu)體雜質(zhì)。為什么呢？因?yàn)閷?shí)際除雜體系中，雜質(zhì)的量一般很少，不會(huì)和API形成共晶，因?yàn)楣簿枰狝PI-配體以特定的摩爾比形成在同一晶格中，所以在除雜中，形成共晶的情況，只能是對(duì)映異構(gòu)體之間形成外消旋化合物。

 

4.1 共沉淀類型識(shí)別和結(jié)晶除雜策略

共沉淀雜質(zhì)殘留機(jī)理是指雜質(zhì)以“雜質(zhì)晶體”的形式與API一起析出，從而導(dǎo)致雜質(zhì)超標(biāo)。共沉淀類型的雜質(zhì)超標(biāo)有個(gè)典型經(jīng)驗(yàn)判斷現(xiàn)象：雜質(zhì)的粒度和晶習(xí)可能與API不一致，導(dǎo)致雜質(zhì)取樣檢測(cè)波動(dòng)比較大，即樣品雜質(zhì)檢測(cè)的“均一性”存在明顯問題。共沉淀類型細(xì)分為兩種情況：SLIP1和SLIP2。

4.1.1 共沉淀類型1（SLIP1）的識(shí)別和結(jié)晶除雜策略

SLIP1雜質(zhì)殘留機(jī)理，識(shí)別的特點(diǎn)是：溶解性實(shí)驗(yàn)中，雜質(zhì)總是比API先溶解，要么是，雜質(zhì)的溶解度比API溶解度高，或者雜質(zhì)含量比較低，逐步增加溶劑過程中，雜質(zhì)優(yōu)先于API溶解，雜質(zhì)在液相中的最大濃度只與溶解度相關(guān)。如下圖7示意圖所示。

圖7 SLIP1溶解實(shí)驗(yàn)示意圖

這種情況下結(jié)晶除雜，主要是尋找thermodynamic certainty（熱力學(xué)上的確定性）；理論上在示意圖7的B區(qū)操作，控制析晶條件讓雜質(zhì)處于不飽和狀態(tài)，不成核不析晶，雜質(zhì)均留在母液中，可以達(dá)到完全的除雜。實(shí)際工業(yè)項(xiàng)目中，這種類型的除雜難度不大，主要需要做好平衡，根據(jù)雜質(zhì)控制水平，平衡好收率和純度指標(biāo)！ 

從上面分析看，SLIP1也是通過控制結(jié)晶條件就能解決除雜問題呀，那為什么SLIP1劃分在復(fù)雜情況里呢？

因?yàn)閷?shí)際生產(chǎn)項(xiàng)目中，其實(shí)最惱火點(diǎn)，在于SLIP1類型的雜質(zhì)問題的出現(xiàn)，具有明顯的滯后性，往往我們?cè)谄髽I(yè)中碰到的是如下這種情況：生產(chǎn)很多批，很多年，產(chǎn)品都是合格的，突然有一批，雜質(zhì)出現(xiàn)問題，排查原因發(fā)現(xiàn)不是工藝參數(shù)問題，而是自發(fā)成核的原因。之前的很多批的析晶條件，雜質(zhì)已經(jīng)到達(dá)過飽和狀態(tài)，但雜質(zhì)未成核，我們都知道自發(fā)成核是隨機(jī)的，雜質(zhì)的隨機(jī)成核并析出，導(dǎo)致雜質(zhì)超標(biāo)。具體的案例可以看文獻(xiàn)Nordstrom, F. L.*; Sirota, E.*; Hartmanshenn, C. Prevalence of Impurity Retention Mechanisms in Pharmaceutical Crystallizations. Org. Process Res. Dev. 2023, 27, 723−741，其中的二聚體雜質(zhì)生產(chǎn)多年都是未檢出，突然生產(chǎn)一批超標(biāo)到達(dá)0.35w%，排查即為上述分析的原因。

 

4.2 共沉淀類型2（SLIP2）的識(shí)別和結(jié)晶除雜策略

共沉淀雜質(zhì)第二種類型SLIP2，識(shí)別的特點(diǎn)是：溶解性實(shí)驗(yàn)中，雜質(zhì)總是比API后溶解，要么是，雜質(zhì)的溶解度比API溶解度低，或者初始雜質(zhì)含量比較高。SLIP2類型是我們?cè)陧?xiàng)目中不想看到的，因?yàn)榻Y(jié)晶反而會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)在產(chǎn)品中富集，即重復(fù)結(jié)晶只會(huì)增加產(chǎn)品中雜質(zhì)的水平，越結(jié)晶API中雜質(zhì)越高，（也就是傳說中，越結(jié)晶越抽抽的類型），并且初始粗品雜質(zhì)水平越高，固相中雜質(zhì)富集程度越嚴(yán)重。

SLIP2逐步溶解實(shí)驗(yàn)中，API優(yōu)先于雜質(zhì)溶解，如下示意圖8所示。特殊條件下，產(chǎn)品完全溶解和雜質(zhì)完全溶解的Vp體積差距足夠大，可以過濾達(dá)到除去大部分雜質(zhì)的目的（圖中B區(qū)操作）。

圖8  SLIP2溶解實(shí)驗(yàn)示意圖

前面提到，SLIP2類型特點(diǎn)是API先溶解，雜質(zhì)后溶解。要么是，雜質(zhì)的溶解度比API溶解度低很多，要么是初始雜質(zhì)含量比較高。根據(jù)這兩種情況分別討論除雜的策略：

第一種情況，雜質(zhì)溶解度遠(yuǎn)小于API溶解度，即熱力學(xué)性質(zhì)上，雜質(zhì)非常難溶。熱力學(xué)的性質(zhì)沒辦法改變，只能改善，因此，研究人員常用的更換結(jié)晶溶劑體系，除雜效果改善有限。比較有效的除雜策略是考慮更換固體形態(tài)（晶型/鹽型/共晶/溶劑化合/水合物），從根本上改變雜質(zhì)和API溶解度的相對(duì)差異，或者上下游溝通結(jié)晶前端除雜，如合成工藝除去這類特定雜質(zhì)。

第二種情況, 初始雜質(zhì)含量特別高導(dǎo)致API全部溶解了，雜質(zhì)仍然有剩余。如下圖9所示示體系，當(dāng)雜質(zhì)含量為5.2wt%時(shí)，雜質(zhì)殘留機(jī)理是SLIP1型，初始雜質(zhì)含量升高為13wt%時(shí)，雜質(zhì)殘留機(jī)理則為SLIP2型。

圖9  SLIP1和2類型與初始雜質(zhì)水平相關(guān)

針對(duì)這種情況，優(yōu)先考慮，拉通上下游，降低初始雜質(zhì)水平至一定水平，將SLIP2型轉(zhuǎn)換為SLIP1型；或者更換溶劑體系，不同溶劑雜質(zhì)和API的溶解差異較大，可以將SLIP2→SLIP1型，然后通過SLIP1型的策略實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)的控制，更換溶劑體系需要對(duì)應(yīng)考慮晶型/晶習(xí)、收率、溶劑殘留等等的影響，這也是“系統(tǒng)性工程”。當(dāng)然更換固體形態(tài)（晶型/鹽型/共晶/溶劑化合/水合物）能達(dá)到除雜，也是策略之一，但具體選擇哪種方法，需要結(jié)合項(xiàng)目特點(diǎn)。

4.3 固體溶液的識(shí)別和結(jié)晶除雜策略

最頭疼的情況，是雜質(zhì)與API形成固體溶液，對(duì)于完全混溶系統(tǒng)，即使是微量的雜質(zhì)（<0.01%）,都會(huì)跟著API一起析出來。固態(tài)溶液的形成與過飽和度、晶體生長(zhǎng)速度等有關(guān)，但能否形成固體溶液的決定性因素是API-雜質(zhì)的混溶性。那怎么識(shí)別雜質(zhì)和API是否形成固體溶液呢？

產(chǎn)業(yè)中現(xiàn)象判斷法：

（1）雜質(zhì)含量較低的固體溶液，不同雜質(zhì)含量的樣品，其XRD與純的API的XRD比較幾乎沒有明顯變化，但其理化性質(zhì)變化明顯：熔點(diǎn)下降、溶解度增加。

（2）雜質(zhì)與API結(jié)構(gòu)非常相似，是判斷形成固體溶液的非常重要的點(diǎn)（如異構(gòu)體雜質(zhì)，元素取代雜質(zhì)等）

存在上述兩種情形，又是非常難除去的雜質(zhì)，就高度懷疑API和雜質(zhì)形成了固體溶液。

當(dāng)然，確診的方法永遠(yuǎn)是相圖，產(chǎn)業(yè)界里快速解決項(xiàng)目問題是核心，一般不會(huì)去繪制相圖，但對(duì)于形成固體溶液的體系，通過DSC繪制二元相圖在企業(yè)實(shí)操上是可以接受的（如圖10所示），一般觀察到趨勢(shì)即可以停止，物料消耗在mg級(jí)別，自動(dòng)進(jìn)樣DSC對(duì)人力上的消耗也相對(duì)有限。

圖10  部分混溶（左）和完全混溶（右）DSC繪制的二元相圖

對(duì)于形成固體溶液的體系，更換固體形態(tài)（晶型/水合物/溶劑合物/成鹽），改變晶體-雜質(zhì)的混溶性質(zhì)（切換熱力學(xué)賽道），是解決問題最根本的方法。那常用的更改溶劑體系、優(yōu)化結(jié)晶工藝、循環(huán)升降溫等動(dòng)力學(xué)操作對(duì)除雜有效果嗎？答案是肯定，但不能根本上解決問題，或者說只能特定條件下解決除雜問題。

這里有一個(gè)典型的案例：日本上市的一個(gè)藥物恩扎魯胺，API結(jié)構(gòu)和難除雜質(zhì)結(jié)構(gòu)非常接近，只有S和O取代的差異（圖11）。

圖11 恩扎魯胺API(左)和難除雜質(zhì)（右）

恩扎魯胺存在多晶型現(xiàn)象，上市晶型采用的是無水晶型R1，無水晶型R1在異丙醇中懸浮打漿可以得到異丙醇溶劑化物R3。研究發(fā)現(xiàn)，R1會(huì)與氧取代雜質(zhì)形成穩(wěn)定的固體溶液，甚至?xí)纬筛哌_(dá)50%的雜質(zhì)含量的固體溶液（stable solid solution up to 50%），但是R3不會(huì)與該雜質(zhì)形成固體溶液。對(duì)于初始雜質(zhì)含量不太高的情形，R1晶型的話，需要重結(jié)晶三次，雜質(zhì)才在限度以內(nèi)（似乎能接受）；而制備成R3晶型的話，一次限度就合格了。如果到結(jié)晶端雜質(zhì)含量非常高，制備R1多次重結(jié)晶或者優(yōu)化結(jié)晶工藝，除雜效果會(huì)大大減弱，但制備成R3晶型，依然可以很好的除雜效果。

 

5、結(jié)語

在企業(yè)，解決問題永遠(yuǎn)會(huì)有很多條路徑。是不是100%完美的技術(shù)方案，不重要！速度+質(zhì)量的平衡，適合此時(shí)此地技術(shù)背景，很重要！

 

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