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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-07-04 09:19
摘 要： 建立高效液相色譜法測(cè)定化妝品中19種非甾體抗炎藥含量?；瘖y品樣品經(jīng)體積比為1∶1的乙腈-乙酸銨溶液超聲提取，用C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）分離，以不同體積比的乙腈-乙酸銨溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，采用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)。布洛芬的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，醋氯芬酸、雙氯芬酸鈉檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，其余16種非甾體的檢測(cè)波長(zhǎng)均為245 nm。19種非甾體的質(zhì)量濃度在5～200 μg/mL范圍內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，檢出限為0.2～8 mg/kg?？瞻讟悠返乃畡┖湍z基質(zhì)的加標(biāo)平均回收率分別為93.1%～110.9%和91.3%～108.1%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.2%～3.5%和0.6%～4.2%（n=6）。該方法適用于化妝品中19種非甾體抗炎藥的測(cè)定。
關(guān)鍵詞： 高效液相色譜法； 非甾體抗炎藥； 化妝品
非甾體抗炎藥物(NSAIDs)是目前臨床應(yīng)用最多、最廣的處方藥之一[1]。其藥理作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制環(huán)氧化酶，減少炎性介質(zhì)前列腺素的合成，從而產(chǎn)生解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用。非甾體抗炎藥物種類繁多，在臨床應(yīng)用過(guò)程中，出現(xiàn)了越來(lái)越多的不良反應(yīng)，如肝損傷[2]、胃腸道[3]及皮膚損害[4]等。某不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心對(duì)2008～2019年5597例有效自發(fā)報(bào)告患者NSAIDs相關(guān)不良反應(yīng)(ADRs)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，5597例ADRs報(bào)告中，累及多個(gè)系統(tǒng)/器官，共計(jì)6915例次，其中皮膚及皮膚附件損害1594例次(占23.05%)，僅次于胃腸系統(tǒng)損害1799例次(占26.02%)[5]。另有統(tǒng)計(jì)評(píng)估顯示，口服NSAIDs治療比外用NSAIDs治療的患者，胃腸道反應(yīng)更常見，而外用NSAIDs組的皮膚反應(yīng)發(fā)生率是口服NSAIDs組的5倍[6]，且雙氯芬酸通過(guò)頸后、頸椎透皮貼劑進(jìn)行脊柱給藥，藥物可從貼片通過(guò)椎間隙擴(kuò)散，穿透硬腦膜進(jìn)入腦脊液，到達(dá)大腦[7]。上述研究揭示了NSAIDs有經(jīng)皮膚吸收進(jìn)而影響人體健康的風(fēng)險(xiǎn)。
近年來(lái)，在部分宣稱祛痘、止癢、修護(hù)類化妝品的監(jiān)督抽檢中篩查出某些含有NSAIDs的化妝品。根據(jù)《已使用化妝品原料目錄名稱(2021年版)》[8]和《化妝品禁用原料目錄》[9]規(guī)定：“對(duì)乙酰氨基酚在淋洗類產(chǎn)品中最高歷史使用量為0.05%，但未提供駐留類產(chǎn)品最高歷史使用量”“非那西丁、辛可芬、異丙安替比林和保泰松為禁用成分”，其他非甾體暫未作規(guī)定?；瘖y品中非甾體大致有以下來(lái)源：一是人為添加，非甾體抗炎藥具有較好的抗炎、止痛和退紅腫作用，特別是祛痘修護(hù)類化妝品中少量添加可緩解炎癥及減少產(chǎn)品成分的刺激，從而達(dá)到較好的效果；二是原料帶入污染。由于非甾體能引起諸多不良反應(yīng)，為保證人民用妝安全和滿足監(jiān)管需求，有必要建立化妝品中非甾體的檢測(cè)方法。
目前，關(guān)于NSAIDs的檢測(cè)方法有液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[10?12]，且大多應(yīng)用在藥品領(lǐng)域，化妝品中尚無(wú)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道。筆者建立了高效液相色譜法測(cè)定水劑和凝膠類化妝品中19種非甾體抗炎藥含量的檢測(cè)方法，為化妝品中非甾體抗炎藥的風(fēng)險(xiǎn)篩查和日常監(jiān)管提供技術(shù)支持，同時(shí)也為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。
1、實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
液相色譜儀：LC-20AT型，配二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司。
超聲波清洗機(jī)：S300H型，德國(guó)艾爾瑪公司。
電子天平：XS205DU型，d=0.01 mg/0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。
超純水機(jī)：Milli-Q IQ 7000型，美國(guó)密理博公司。
高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf 5810R型，德國(guó)艾本德公司。
乙腈：色譜純，美國(guó)霍尼韋爾公司。
乙酸銨：色譜級(jí)，純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不小于99.0%，上海麥克林生化科技有限公司。
冰乙酸：色譜級(jí)，上海麥克林生化科技有限公司。
對(duì)乙酰氨基酚、阿司匹林、4-甲氨基安替比林、安替比林、氨基比林、非那西丁、普拉洛芬、舒林酸、醋氯芬酸、異丙安替比林、酮洛芬、萘普生、艾瑞昔布、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、布洛芬、保泰松、塞來(lái)昔布18種非甾體抗炎藥標(biāo)準(zhǔn)品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))均大于98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。
辛可芬標(biāo)準(zhǔn)品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為100%，阿法埃莎(中國(guó))化學(xué)有限公司。
實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
化妝品樣品：市售。
1.2 溶液配制
乙酸銨溶液：0.02 mol/L，稱取1.54 g乙酸銨，加入950 mL水溶解，用冰乙酸調(diào)pH值至4.2，再加水至1 000 mL。
乙腈-乙酸銨溶液：取乙腈和0.02 mol/L乙酸銨溶液，按體積比1∶1混勻即得。
19種非甾體抗炎藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精密稱取19種非甾體抗炎藥標(biāo)準(zhǔn)品各約10.0 mg，置于同一只10 mL棕色容量瓶中，用乙腈-乙酸銨溶液溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成19種非甾體抗炎藥的質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。
19種非甾體抗炎藥系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取19種非甾體抗炎藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，用乙腈-乙酸銨溶液稀釋，配制成19種非甾體抗炎藥的質(zhì)量濃度均分別為5、10、20、50、100、200 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.3 儀器工作條件
色譜柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm，5 µm，日本OSAKA SODA公司)；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.02 mol/L乙酸銨溶液；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：布洛芬的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，醋氯芬酸、雙氯芬酸鈉的檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，其余16種非甾體物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)均為245 nm；流量：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 µL；梯度洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
Tab. 1 Gradient elution procedure
1.4 樣品處理
精密稱取樣品1.0 g于10 mL比色管中，加入適量乙腈-乙酸銨溶液，渦旋分散1 min，加入乙腈-乙酸銨溶液至近標(biāo)線，超聲提取20 min，放置至室溫，用乙腈-乙酸銨溶液定容至標(biāo)線，搖勻，取上清液用
0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，即為樣品溶液。
2、 結(jié)果與討論
2.1 色譜柱選擇
分別考察兩種粒徑(3 µm和5 µm)的OSAKA SODA CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm)對(duì)19種非甾體物質(zhì)的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用3 µm粒徑的C18柱時(shí)，色譜峰型較好，但一些非甾體物質(zhì)較難分離，且出峰時(shí)間延長(zhǎng)。采用5 µm粒徑的C18柱時(shí)，布洛芬、保泰松和塞來(lái)昔布色譜峰形稍寬，但能將19種非甾體物質(zhì)較好分離，不影響各組分的定性定量。綜合考慮，選擇OSAKA SODA CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)作為分離柱。
2.2 流動(dòng)相選擇
參考相關(guān)文獻(xiàn)[13?22]，分別選擇乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液和甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，以乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)，19種非甾體物質(zhì)均能出峰，且調(diào)整比例后能達(dá)到分離要求；以甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)，組分出峰時(shí)間延后，且布洛芬、保泰松、塞來(lái)昔布等組分無(wú)色譜峰，因此選用乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。
2.3 提取溶劑及超聲時(shí)間選擇
分別考察甲醇、乙腈、乙腈-乙酸銨溶液(體積比為75∶25)和乙腈-乙酸銨溶液(體積比為1∶1) 4種不同提取溶劑及不同超聲時(shí)間(10、20、30 min)時(shí)的樣品處理效果。結(jié)果表明，以乙腈、乙腈-乙酸銨溶液(體積比為75∶25)為提取溶劑時(shí)，提取效果較差；以甲醇、乙腈-乙酸銨溶液(體積比為1∶1)為提取溶劑、超聲20 min時(shí)均能較好地提取樣品中的非甾體，考慮到流動(dòng)相溶劑及溶劑峰的影響，選擇乙腈-乙酸銨溶液(體積比為1∶1)作為提取溶劑，超聲時(shí)間為20 min。
2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇
對(duì)19種非甾體物質(zhì)在190～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分非甾體在245 nm附近均有較強(qiáng)的紫外吸收，而布洛芬在230 nm附近有較大紫外吸收，其響應(yīng)值是245 nm處的16倍多，醋氯芬酸、雙氯芬酸鈉在278 nm附近有較大紫外吸收，其響應(yīng)值是245 nm處的2倍左右。為了提高檢測(cè)靈敏度，選擇布洛芬的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，醋氯芬酸、雙氯芬酸鈉檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，其余16種非甾體的檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm。
2.5 專屬性試驗(yàn)
分別取空白樣品溶液、19種非甾體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及加標(biāo)樣品溶液，按1.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖如圖1所示。圖1結(jié)果表明，空白樣品溶液無(wú)干擾，加標(biāo)樣品溶液中19種非甾體物質(zhì)的保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中19種非甾體物質(zhì)保留時(shí)間一致，19種非甾體物質(zhì)的分離效果和峰型均良好，表明該方法具有良好的專屬性。
圖1 空白樣品溶液、19種非甾體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)樣品溶液色譜圖
Fig. 1 Chromatograms of blank sample solution，19 non-steroidal mixed standard solution and spiked sample solution
1—對(duì)乙酰氨基酚；2—阿司匹林；3—4-甲氨基安替比林； ；4—安替比林；5—氨基比林；6—辛可芬；7—非那西??； ；8—普拉洛芬；9—醋氯芬酸；10—舒林酸；11—異丙安替比林； ；12—酮洛芬；13—萘普生；14—艾瑞昔布；15—雙氯芬酸鈉； ；16—吲哚美辛；17—布洛芬；18—保泰松；19—塞來(lái)昔布
2.6 線性方程與方法檢出限
取19種非甾體抗炎藥系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液各組分質(zhì)量濃度(x，µg/mL)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到各組分的線性方程與相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。取質(zhì)量濃度為5 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋并檢測(cè)，分別以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限和定量限，根據(jù)樣品取樣質(zhì)量為1.0 g，稀釋10倍體積換算為樣品中的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。19種非甾體抗炎藥的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表2。
表2 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限
Tab. 2 Linear range of mass concentration，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantification limit
2.7 加標(biāo)回收率與精密度試驗(yàn)
選取空白樣品的水劑和凝膠基質(zhì)，分別加入適量的19種非甾體抗炎藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4方法制備3種不同質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)樣品溶液，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。由表3可知，在水劑和凝膠基質(zhì)中的平均回收率分別為93.1%～110.9%和91.3%～108.1%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.2%～3.5%和0.6%～4.2%。表明該方法在水劑和凝膠兩種基質(zhì)中均具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。
表3 加標(biāo)回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
Tab. 3 Results of spiked recoveries and precision test (n=6)
2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)
在一定條件下，有些非甾體不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生降解或分解，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)19種非甾體進(jìn)行日間(24 h)穩(wěn)定性考察。取質(zhì)量濃度為20 μg/mL的同一19種非甾體標(biāo)準(zhǔn)溶液，每隔一段時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各組分在不同時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量濃度，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表4。由表4可知，在24 h內(nèi)19種非甾體標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度無(wú)太大變化，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～2.4%，表明在室溫條件下標(biāo)準(zhǔn)溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 4 Stability test results
3、 結(jié)語(yǔ)
建立了高效液相色譜測(cè)定化妝品中19種非甾體抗炎藥的檢測(cè)方法。該方法樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、靈敏度高，適用于水劑和凝膠類化妝品中19種非甾體物質(zhì)的定量檢測(cè)。該方法綜合擴(kuò)充了化妝品中非甾體的檢測(cè)種類，可為日后化妝品中非甾體的非法添加及質(zhì)量監(jiān)管提供參考。
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來(lái)源：化學(xué)分析計(jì)量
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