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保證藥品安全、有效、質(zhì)量可控是藥物研發(fā)和評(píng)價(jià)應(yīng)遵循的基礎(chǔ)原則。對(duì)藥品進(jìn)行質(zhì)量控制是保證藥品安全有效的基礎(chǔ)和前提。為達(dá)到控制質(zhì)量的目的，需要多角度、多層面來(lái)控制藥品質(zhì)量，也就是說(shuō)要對(duì)藥物進(jìn)行多個(gè)項(xiàng)目測(cè)試，來(lái)全面考察藥品質(zhì)量。一般地，每一測(cè)試項(xiàng)目可選用不同的分析方法，為使測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，必須對(duì)所采用的分析方法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可行性進(jìn)行驗(yàn)證，以充分表明分析方法符合測(cè)試項(xiàng)目的目的和要求，這就是通常所說(shuō)的對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

 

方法驗(yàn)證的目的是判斷采用的分析方法是否科學(xué)、合理，是否能有效控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量。從本質(zhì)上講，方法驗(yàn)證就是根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的要求，預(yù)先設(shè)置一定的驗(yàn)證內(nèi)容，并通過(guò)設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證所采用的分析方法能否符合檢測(cè)項(xiàng)目的要求。

 

方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容-檢出限和定量限

 

檢測(cè)限和定量限是分析方法的重要屬性，在中國(guó)藥典2020年版分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中規(guī)定這2項(xiàng)是重要的驗(yàn)證指標(biāo)，定量分析需考慮定量限；限度分析需測(cè)定檢測(cè)限，且在該版本指導(dǎo)原則中刪除了校正因子以及其中定量限的規(guī)定。

 

根據(jù)ICH Q2 以及各國(guó)藥典方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容一般需要評(píng)價(jià)的典型驗(yàn)證項(xiàng)目有: 專屬性、準(zhǔn)確度、精密度( 重復(fù)性和中間精密度) 、檢測(cè)限、定量限、線性、范圍和耐用性等。根據(jù)分析方法的類型不同，需要驗(yàn)證的項(xiàng)目不同，見(jiàn)表1。

 

 

定義

 

 

檢測(cè)限（Limit of Detection，LOD）：系指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量。檢測(cè)限僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒(méi)有定量意義。因此需要注意的是在檢出限附近不能進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，且報(bào)告未檢出時(shí)應(yīng)附上方法的檢測(cè)限。

 

檢測(cè)限的測(cè)定是通過(guò)對(duì)一系列已知濃度被測(cè)物的試樣進(jìn)行分析，并以能準(zhǔn)確、可靠檢測(cè)被測(cè)物的最小量或最低濃度來(lái)建立。

 

定量限（Limit of Quantitation，LOQ）：系指試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量。其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。

 

定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測(cè)能力。雜質(zhì)定量試驗(yàn)，需考察方法的定量限，以保證含量很少的雜質(zhì)能夠被準(zhǔn)確測(cè)出。

 

另外需要注意的是：

 

•定量限/檢測(cè)限有些地方會(huì)翻譯為Quantitation limit，QL和Detection Limit，DL，這個(gè)根據(jù)各個(gè)公司自己規(guī)定執(zhí)行即可。

 

檢測(cè)限和定量限的測(cè)量方法

 

 

指導(dǎo)原則中規(guī)定了三種方法測(cè)定檢測(cè)限和定量限：

 

（1）直觀法：用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢出（或定量測(cè)定）的最低濃度或量。

 

對(duì)于目測(cè)法而言，需要提供逐級(jí)稀釋的圖譜，并說(shuō)明稀釋過(guò)程。如下圖采用采用初始濃度0.4ng/ml逐級(jí)稀釋，最后目測(cè)觀察0.10ng/ml的濃度相當(dāng)于檢測(cè)限濃度。

 

（2）信噪比法：用于能顯示基線噪聲的分析方法，即將已知低濃度試樣檢出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢出（或定量）的被測(cè)物質(zhì)最低濃度或量。一般以信噪比3:1或2:1時(shí)（或10:1）相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限（或定量限）。

 

（3）基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法。按照LOD=3.3δ/S或LOQ=10δ/S公式計(jì)算，式中LOD為檢測(cè)限，LOQ為定量限，δ為響應(yīng)值的偏差，S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。其中δ可以通過(guò)以下方法獲得：①測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；②采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)代替。

 

方法學(xué)驗(yàn)證中，應(yīng)在申報(bào)資料中說(shuō)明是采用上述何種方法來(lái)測(cè)定檢測(cè)限或定量限的。

 

檢測(cè)限和定量限的常見(jiàn)問(wèn)題

 

檢測(cè)限和定量限常采用信噪比法測(cè)定。該計(jì)算方法下的檢測(cè)限與定量限是通過(guò)對(duì)照品逐級(jí)稀釋的方法獲得的，沒(méi)有考慮任何樣品制備步驟的影響，因此其值往往比分析方法本身的實(shí)際檢測(cè)限與定量限低，而且每臺(tái)儀器也不一樣，因此信噪比法是用來(lái)考察儀器本身性能的，與方法本身的檢測(cè)限或定量限還是不一樣的。信噪比法受到的影響因素比較多，例如所用色譜柱的柱效、檢測(cè)器的氘燈壽命等。例如，下圖中峰形尖銳的信噪比高，s/n=11，此時(shí)檢測(cè)限和定量限都較低。

 

盡管信噪比法有諸多問(wèn)題，但目前仍是方法學(xué)驗(yàn)證中最常用的計(jì)算方法。從目前國(guó)內(nèi)提交的申報(bào)資料來(lái)看，檢測(cè)限和定量限評(píng)價(jià)一般采用信噪比的方法來(lái)確定，存在問(wèn)題較小，有時(shí)，為了保證方法的靈敏度，有時(shí)可采用靈敏度較好的PDA/DAD檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)限和定量限的考察。

 

通常檢測(cè)限應(yīng)低于限度的1/30，定量限應(yīng)低于限度的1/10，如果達(dá)不到這一要求，可適當(dāng)放寬，只要規(guī)定定量限應(yīng)比ICH規(guī)定的雜質(zhì)的報(bào)告限低即可（例如50%報(bào)告限）。

 

由于靈敏度受儀器、色譜柱、試劑、泵系統(tǒng)、檢測(cè)器等的影響很大，因此為了保證方法的檢測(cè)能力，有些藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了靈敏度溶液的信噪比作為系統(tǒng)適用性要求來(lái)考察整個(gè)色譜系統(tǒng)的靈敏度，相信這種方法以后會(huì)應(yīng)用越來(lái)越多。

 

在指導(dǎo)原則中還有一句話很重要：“上述方法獲得的檢測(cè)限和定量限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)附測(cè)試圖譜，說(shuō)明測(cè)試過(guò)程和定量限結(jié)果，包括準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)。”

 

如何進(jìn)行檢測(cè)限和定量限的驗(yàn)證呢？常見(jiàn)的做法是采用雜質(zhì)加標(biāo)的方法進(jìn)行驗(yàn)證，例如在供試品溶液中加入相當(dāng)于檢測(cè)限或定量限濃度的雜質(zhì)，考察加入后的色譜圖中信噪比是否符合要求。定量限的精密度驗(yàn)證目前基本都做到了，常采用配制6份定量限濃度的溶液，所測(cè)6份溶液雜質(zhì)峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于5.0%的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。有時(shí)也進(jìn)行定量限濃度的準(zhǔn)確度驗(yàn)證，可接受限度可參考上述準(zhǔn)確度項(xiàng)下的規(guī)定，有時(shí)也可以適當(dāng)放寬。

 

對(duì)于滴定方法而言，不必驗(yàn)證方法的檢測(cè)限和定量限，而應(yīng)更重視方法的準(zhǔn)確性、精密度和專屬性。

 

參考文獻(xiàn)

 

[1] 中國(guó)藥典2020年版通則9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則（第二次征求意見(jiàn)稿）

 

[2]梅希，2020版藥典9101<分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則>要點(diǎn)淺析：藥事縱橫

 

[23]李飛1，李云2：對(duì)藥物研發(fā)中分析方法驗(yàn)證的幾點(diǎn)考慮，中國(guó)新藥雜志 2021.05