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本文是印度制藥專家在2023年12月發(fā)表的一篇綜述，內(nèi)容涉及到亞硝胺的毒理學(xué)影響、產(chǎn)生的根本原因，風(fēng)險評估及解決方式的探討。

 

藥品中N-亞硝基化合物，特別是N-亞硝胺的存在由于其顯著的遺傳毒性和誘變作用而引起了全球安全性問題。本文綜述研究了它們在活性藥物成分(API)、藥品和藥用輔料中的毒性，以及用于檢測的新分析策略、根本原因分析、重新制劑改良策略和亞硝胺的監(jiān)管指南。強(qiáng)調(diào)了N-亞硝基化合物的分子毒性，重點是遺傳毒性、致突變性、致癌性和其他生理效應(yīng)。此外論述了持續(xù)的亞硝胺危機(jī)、無亞硝胺產(chǎn)品的開發(fā)以及靈敏檢測方法和精確風(fēng)險評估的重要性。

 

1.介紹

亞硝胺雜質(zhì)，即使是痕量也具有劇毒和誘變性，它能夠破壞DNA，并隨后增加癌癥發(fā)病率的風(fēng)險。監(jiān)管機(jī)構(gòu)在各種活性藥物成分（API）和其他批準(zhǔn)的藥物中發(fā)現(xiàn)了亞硝胺雜質(zhì)，導(dǎo)致沙坦類藥物（纈沙坦）、雷尼替丁（zantac）、尼扎替丁、二甲雙胍和伐尼克蘭在市場上的被召回。

由于亞硝胺雜質(zhì)水平不可接受，近年來監(jiān)管機(jī)構(gòu)已將重點轉(zhuǎn)向一類新型亞硝胺雜質(zhì)，稱為亞硝胺原料藥相關(guān)雜質(zhì)(NDSRI)，其結(jié)構(gòu)與API相似。最近涉及NDSRIs的事件包括鹽酸喹那普利，其中檢測到N-亞硝基喹那普利的存在。枸櫞酸奧芬那君腸溶釋放片顯示N-亞硝基奧芬那君為雜質(zhì)。伐尼克蘭中的N亞硝基伐尼克蘭（NNV）是通過原料藥與輔料中存在的亞硝酸鹽反應(yīng)形成的。

根據(jù)國際人用藥品技術(shù)要求協(xié)調(diào)委員會（ICH）M7指南，亞硝胺雜質(zhì)被歸類為1類已知致突變雜質(zhì)。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）根據(jù)流行病學(xué)數(shù)據(jù)將這些雜質(zhì)分為2A組和2B組，N-亞硝基二甲胺（NDMA）和NDEA屬于2A組，而其他亞硝胺被歸類為2B組人類致癌物。所選亞硝胺和NDSRIs的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

為了解決亞硝胺危機(jī)，美國藥典(USP)正在托管一個名為“亞硝胺交換”的虛擬平臺。該平臺匯集了制藥公司、合同研究組織（CRO）、API制造商和輔料供應(yīng)商，以促進(jìn)與亞硝胺問題相關(guān)的實時溝通、更新和風(fēng)險評估。此外，USP還建立了一個“亞硝胺分析中心”，提供測試亞硝基地雷的新型分析方法的更新。

 

圖1:各種亞硝胺雜質(zhì)和亞硝胺原料藥相關(guān)雜質(zhì)（NDSRIs）的化學(xué)結(jié)構(gòu)。NDMA：N-亞硝基二甲胺；NDEA：N-亞硝基二乙胺；NMBA：N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸；NDBA：N-亞硝基二丁胺；MeNP：1-甲基-4-亞硝基哌嗪；NNV：N-亞硝基-伐尼克蘭；NMOR：N亞硝基嗎啉；NIPEA：N-亞硝基異丙基乙胺；NDIPA：N-亞硝基二異丙胺；NMPA：N-亞硝基甲基苯胺

藥物管制監(jiān)管機(jī)構(gòu)規(guī)定了API和藥品中各種亞硝胺雜質(zhì)和NDSRIs的可接受每日攝入量限值。例如這些限制包括N-亞硝基二甲胺（NMDA）和N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）為96 ng/天，N-亞硝基甲基苯胺（NMPA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）、N-亞硝基異丙基乙胺（NIPEA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）和1-甲基-4-亞硝基哌嗪（MeNP）為26.5 ng/天，NNV為37 ng/天，N-亞硝基嗎啉（NMOR）為127 ng/天，如圖2所示。

 

圖2: 根據(jù)監(jiān)管機(jī)構(gòu)，藥品中選定的亞硝胺雜質(zhì)和亞硝胺原料藥相關(guān)雜質(zhì)（NDSRIs）的每日可接受攝入量限度。NDMA：N-亞硝基二甲胺；美國FDA：美國食品藥品監(jiān)督管理局；EMA：歐洲藥品管理局；世衛(wèi)組織：世界衛(wèi)生組織；NDEA：N-亞硝基二乙胺；NNV：N-亞硝基-伐尼克蘭；NMBA：N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸；NDIPA：N-亞硝基二異丙胺；NMPA：N-亞硝基甲基苯胺；NDBA：N-亞硝基二丁胺；EIPNA：N-亞硝基乙基異丙胺；MeNP：1-甲基-4-亞硝基哌嗪；NMOR：N-亞硝基嗎啉

促進(jìn)亞硝胺形成的條件包括易反應(yīng)性胺的存在，如仲胺和叔胺。這些胺在酸性條件下與亞硝酸反應(yīng)，導(dǎo)致亞硝胺的形成。亞硝酸本身是不穩(wěn)定的，在酸性條件下由亞硝酸鹽（NO2）形成。亞硝胺雜質(zhì)也可能來自供應(yīng)商來源的原材料中的污染，包括含亞硝酸鹽的起始材料、中間體以及合成過程中溶劑、反應(yīng)物、催化劑和試劑的重復(fù)使用。在藥品生產(chǎn)過程中，應(yīng)仔細(xì)評估幾個因素，如添加劑、防腐劑、賦形劑和彈性體成分的選擇，因為它們會導(dǎo)致藥品中亞硝胺的產(chǎn)生。此外，生產(chǎn)后因素，如水分含量、pH值和產(chǎn)品的儲存溫度也可能導(dǎo)致亞硝胺的產(chǎn)生。原料藥或藥品的配方設(shè)計師應(yīng)考慮這些因素，并采取必要措施減少藥品中的亞硝胺雜質(zhì)。此外，如果易受傷害的胺和亞硝酸鹽被消耗，亞硝胺也可能在胃腸道中形成。藥品中亞硝胺雜質(zhì)的根本原因和來源在圖3中以魚骨圖的形式表示。

 

圖3: 活性藥物成分（API）和醫(yī)藥產(chǎn)品中亞硝胺雜質(zhì)的根本原因和來源

亞硝胺危機(jī)導(dǎo)致的藥物召回導(dǎo)致供應(yīng)鏈中斷和市場上幾種藥物短缺，引起了全球患者的擔(dān)憂。它也影響了臨床藥物開發(fā)過程。藥物相互作用研究受到二甲雙胍、利福平、雷尼替丁、尼扎替丁和普萘洛爾等關(guān)鍵藥物召回的影響。實驗研究和計算機(jī)方法可以方便地從理論上預(yù)測許多含有仲胺和叔胺的藥物中亞硝胺的形成。

本文綜述藥品、藥用輔料和原料藥中N-亞硝基化合物的毒性的重要研究和討論，主要關(guān)注N-亞硝胺。此外，它還涵蓋了生理系統(tǒng)中這些雜質(zhì)的分子毒性特征的最新更新。此外，該綜述還研究了用于靈敏檢測和定量這些危險雜質(zhì)的新穎、更新的分析策略。它深入研究了亞硝胺雜質(zhì)存在的根本原因，并為藥品提供了有見地的改良制劑策略。此外它還提供了旨在減少這些亞硝胺雜質(zhì)發(fā)生的法規(guī)更新。

 

2、 文獻(xiàn)調(diào)研

通過訪問公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了文獻(xiàn)檢索，包括PubMed、Medline、eMedicine、國家醫(yī)學(xué)圖書館(NLM)和ReleMed。我們重點關(guān)注已發(fā)表的文章，包括原創(chuàng)研究、綜述文章、病例報告和其他系統(tǒng)綜述，有和未有綜合薈萃分析，與藥用輔料、原料藥和藥品中的N-亞硝基化合物相關(guān)。我們收集與更新的分子毒性含義相關(guān)的信息與亞硝胺雜質(zhì)相關(guān)以及多水平方法對靈敏檢測的影響。我們對180篇文章的初步篩選產(chǎn)生了本研究的相關(guān)數(shù)據(jù)。本研究收集的所有數(shù)據(jù)均符合系統(tǒng)綜述和薈萃分析首選報告項目（PRISMA）聲明中概述的指南。我們對選定的文章進(jìn)行了自動搜索和手動排序。

2.1 研究選擇

在本綜述中，納入了所有已發(fā)表或接受的與亞硝胺相關(guān)主題相關(guān)的文章，特別關(guān)注藥物中的毒性和分析意義。最初篩選了從1960年至今的總共180篇文章，包括原始研究、綜述、病例報告和報告亞硝胺雜質(zhì)高于監(jiān)管機(jī)構(gòu)確定的無觀察到不良反應(yīng)水平（NOAEL）的研究。在初步篩選過程中，我們考慮了相關(guān)性、出版日期、全文訪問和內(nèi)容等因素。隨后，在二次篩選階段，我們排除了33份報告，包括15份格式不當(dāng)（如病例報告、信件和簡短通信），3份內(nèi)容不完整，15份全文不可用。這一過程導(dǎo)致選擇了147篇文章進(jìn)行進(jìn)一步評估。其中，2篇文章被排除在研究之外，2篇文章沒有描述亞硝胺誘導(dǎo)的毒性或其藥學(xué)或分析意義。最終選擇143篇文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)綜述。通過主要和次要篩選納入研究的文章的排除和納入標(biāo)準(zhǔn)的示意圖如方案1所示。

 

 

方案1: 通過主要和次要篩選納入研究的文章的排除和納入標(biāo)準(zhǔn)的示意圖

我們最初的重點是收集有關(guān)亞硝胺引起的毒性、副作用或亞硝胺雜質(zhì)引發(fā)的生理毒性的信息。此外，我們旨在探索靈敏檢測亞硝胺雜質(zhì)的分析技術(shù)，并提出亞硝胺雜質(zhì)的監(jiān)管更新。

2.2數(shù)據(jù)選擇

根據(jù)“流行病學(xué)觀察性研究的系統(tǒng)綜述”中概述的國際標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)選擇和分類遵循特定的標(biāo)準(zhǔn)。這些標(biāo)準(zhǔn)包括討論亞硝胺誘導(dǎo)的毒性、其他神經(jīng)系統(tǒng)或全身并發(fā)癥的文章數(shù)量、發(fā)表年份和類型，以及描述亞硝胺誘導(dǎo)的毒性相關(guān)信號通路的臨床前研究，用于毒性管理。為了便于分類，我們將數(shù)據(jù)分為三個主要組：描述“亞硝胺雜質(zhì)引發(fā)的副作用或生理毒性”的文章、專注于“敏感檢測亞硝胺雜質(zhì)的分析技術(shù)”的文章以及旨在“提出亞硝胺雜質(zhì)監(jiān)管更新”的文章。分別對這三類的結(jié)果進(jìn)行了審查和分析。這種系統(tǒng)的方法使我們能夠解決關(guān)鍵的推論，這可能證明對分子生物學(xué)家、分析科學(xué)家、研發(fā)部門的制劑科學(xué)家和參與亞硝胺誘導(dǎo)毒性管理的研究人員。

 

3.亞硝胺雜質(zhì)的分子毒性

NDMA、NDEA、N-亞硝基乙基異丙胺(NEIPA)、NDIPA、N-亞硝基二丁胺(NDBA)和NMBA是主要的亞硝胺，它們可以通過生理系統(tǒng)中的遺傳毒性或誘變性促進(jìn)致癌作用。近年來，正如在嚙齒動物模型中觀察到的那樣，很明顯，幾種藥品中的雜質(zhì)會對人類健康造成重大風(fēng)險。例如，NMBA和NDEA與NMDA和12種致癌N-亞硝基甲基-N-烷基胺(NMA)具有代謝相似性。在亞硝胺誘導(dǎo)的毒性研究中，通過檢查染色體畸變、姐妹染色單體交換和微核形成來評估遺傳毒性和致瘤性。

3.1 基因毒性

亞硝胺雜質(zhì)如NDMA、NDEA等可誘導(dǎo)致突變作用，隨后從而導(dǎo)致致癌性。由于體內(nèi)遺傳毒性模型，NDMA已被證明會誘導(dǎo)突變。細(xì)胞色素P450（CYP450）酶如CYP2E1和CYP2A6參與N-亞硝胺的代謝并形成N-亞硝基二烷基胺。例如，在嚙齒動物模型中，CYP2E1與幾種底物的代謝有關(guān)，包括有機(jī)溶劑、亞硝胺和其他藥物分子。此外，CYP3A4在催化更大的N-亞硝胺的活化中發(fā)揮作用。CYP2E1的差異表達(dá)在不同的體外或體內(nèi)模型中調(diào)節(jié)亞硝胺代謝。

4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)介導(dǎo)的DNA損傷的遺傳毒性包括甲基DNA堿基加合物的形成，例如O6-Me-dGuo和N7-Me-dGuo。由健康細(xì)胞中N-亞硝胺活性產(chǎn)生的其他遺傳毒性產(chǎn)物包括甲基DNA堿基加合物和吡啶氧代丁基(POB)DNA堿基加合物，包括O6-POB-dGuo和O2-POB-Thd。醛DNA加合物也是由于亞硝胺雜質(zhì)的存在而形成的顯著遺傳毒性產(chǎn)物。然而，吡啶基羥基丁基DNA加合物需要進(jìn)一步廣泛的研究來探索亞硝胺的確切性質(zhì)雜質(zhì)。表1概述了N-亞硝基化合物在幾種體內(nèi)模型中通過各種給藥途徑的致癌潛力。

表1: N-亞硝基化合物在幾種體內(nèi)模型中不同給藥途徑的致癌潛力

 

此外，由于藥物成分或藥物中這些亞硝胺的活性，DNA損傷形成，導(dǎo)致O6-甲基鳥嘌呤或3-甲基腺嘌呤（3MeA）的形成。DNA甲基化主要由NDMA誘導(dǎo)，未修復(fù)的3MeA可促進(jìn)致突變性，隨后導(dǎo)致癌癥。通常，3MeA誘導(dǎo)的DNA損傷由烷基腺嘌呤糖基化酶修復(fù)，烷基腺嘌呤糖基化酶消除甲基化堿基，觸發(fā)堿基切除修復(fù)。因此，烷基腺嘌呤糖基化酶的活性對于最小化亞硝胺雜質(zhì)如NDMA誘導(dǎo)的致突變性至關(guān)重要。

3.2 致癌性

幾份流行病學(xué)報告描述了亞硝胺對患食道癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌和其他破壞性癌癥的風(fēng)險的影響。

3.3肺癌

肺癌可以由亞硝胺雜質(zhì)誘導(dǎo)，因為它們具有通過調(diào)節(jié)G蛋白信號傳導(dǎo)、煙堿乙酰膽堿受體(nAchR)信號傳導(dǎo)和表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導(dǎo)來刺激增殖、遷移和癌細(xì)胞存活的能力。例如，亞硝胺對EGFR信號傳導(dǎo)的影響可誘導(dǎo)環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A-快速加速纖維肉瘤-絲裂原活化蛋白激酶激酶-細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（cAMP-PKA-RAF-MEK-ERK1/2）軸發(fā)生變化，隨后促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。類似地，EGFR調(diào)節(jié)可以引起磷酸肌醇-3-激酶-Akt-雷帕霉素哺乳動物靶標(biāo)（PI3K-AktMtor）信號通路的改變，以促進(jìn)癌細(xì)胞存活。亞硝胺還誘導(dǎo)nAChR信號傳導(dǎo)、電壓門控鈣通道(VGCC)、鈣信號傳導(dǎo)和蛋白激酶C(PKC)調(diào)節(jié)的變化，其通過遷移和存活促進(jìn)癌癥進(jìn)展。當(dāng)亞硝胺與這些受體相互作用時，HIF1-α信號傳導(dǎo)也受β-腎上腺素能信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)，這些受體隨后引起血管生成以向增殖的癌細(xì)胞提供營養(yǎng)。

3.2.2.食管癌

食管癌具有較高的發(fā)病率和廣泛的地理流行，表明環(huán)境因素參與了其發(fā)展。毒理基因組學(xué)過去的報道已經(jīng)描述了亞硝胺在食管癌發(fā)生中的作用。趙等人的一項研究。[64]闡明了亞硝胺在食管上皮中誘導(dǎo)致癌性的潛力。在這項研究中，作者檢測了食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）、基底細(xì)胞增生和癌前病變相關(guān)患者的尿亞硝胺水平，并將其與健康個體進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，NMEA、NDBA、亞硝基吡咯烷（NPYR）和NMOR水平升高的ESCC患者的風(fēng)險更高。根據(jù)本報告，危險暴露于N-亞硝基甲基乙胺(NMEA)、NDBA和NPYR的患者發(fā)生ESCC的風(fēng)險較高，表明亞硝胺暴露與食管癌發(fā)病率之間存在特定的劑量反應(yīng)關(guān)系。

3.2.3.肝細(xì)胞癌和胰腺癌

肝細(xì)胞癌是由P450酶參與的亞硝胺代謝引起的致死性癌癥之一。生活方式因素，如飲食中暴露于較高水平的亞硝胺或N-亞硝基化合物，與癌癥的發(fā)展有關(guān)。這些化合物特異性地在位于消化器官和肝臟的細(xì)胞核中形成DNA加合物，導(dǎo)致亞硝基化合物的致癌性。此外，含有這些化合物的食品加工添加劑是人類接觸亞硝胺的重要來源。Zheng等人的一項研究。探討了特定N-亞硝基化合物、總N-亞硝基化合物的膳食攝入量與肝細(xì)胞癌發(fā)生之間的關(guān)系。作者得出結(jié)論，較高的N-亞硝基化合物攝入量可能會增加肝細(xì)胞癌發(fā)病率的風(fēng)險，與其他風(fēng)險因素如乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染或酒精攝入有關(guān)。

NDEA和NDMA主要是藥物中發(fā)現(xiàn)的重要亞硝基化合物，這些被歸類為人類2A組致癌物。CYP450酶的代謝激活可以誘導(dǎo)親電烷基化，導(dǎo)致突變誘導(dǎo)的DNA加合物的形成。肝酶在亞硝胺的代謝中起著重要作用，與其他肝外組織相比，在肝臟中觀察到更大的活性。關(guān)于亞硝胺的劑量-反應(yīng)關(guān)系表明，NDMA和NDEA在體內(nèi)模型中誘導(dǎo)肝腫瘤。在體內(nèi)模型和人類顯著暴露于亞硝胺的肝腫瘤中都觀察到DNA加合物的形成。N-亞硝胺誘導(dǎo)烷基中α-碳原子的羥基化，在肝細(xì)胞中產(chǎn)生羥基亞硝胺，隨后促進(jìn)DNA烷基化。這些連續(xù)事件進(jìn)一步引起基因損傷、突變，并通過觸發(fā)致癌信號賦予肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，如圖4所示。此外，暴露于N-亞硝胺通過線粒體DNA、氧化磷酸化（OXPHOS）信號和其他線粒體代謝途徑的改變影響肝臟脂質(zhì)代謝。亞硝胺的另一種機(jī)制涉及通過氧化應(yīng)激、三磷酸腺苷(ATP)耗竭和脂肪酸氧化相關(guān)酶的下降誘導(dǎo)肝組織炎癥。

圖4:亞硝胺在各種類型癌癥中的分子信號通路。（i）肺癌：亞硝胺可通過調(diào)節(jié)G蛋白信號傳導(dǎo)、煙堿乙酰膽堿受體（nAchR）信號傳導(dǎo)和表皮生長因子受體（EGFR）信號傳導(dǎo)來刺激癌細(xì)胞增殖、遷移和存活。（ii）乳腺癌：亞硝胺調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶/環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）通路，該通路介導(dǎo)EGFR信號通路反式激活。（iii）肝癌：N-亞硝胺暴露通過改變線粒體DNA、OXPHOS信號和其他線粒體代謝途徑影響肝臟脂質(zhì)代謝。I：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-泛醌氧化還原酶復(fù)合物；II：琥珀酸-泛醌氧化還原酶復(fù)合物；III：細(xì)胞色素Bc1復(fù)合物；IV：細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合物；和V：三磷酸腺苷合酶復(fù)合物；B-AR：B-腎上腺素能受體；Adr：腎上腺素；NAdr：去甲腎上腺素；HIF1a：缺氧誘導(dǎo)因子1a；VEGF：蛋白激酶B；RAF：快速加速纖維肉瘤；PKC：蛋白激酶C；ERK：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶；MEK：絲裂原活化蛋白激酶激酶；RAP-1：Ras相關(guān)蛋白1；BAD：細(xì)胞死亡蛋白的BCL2相關(guān)激動劑；mTor：雷帕霉素的哺乳動物靶標(biāo)；PI3K：磷酸肌醇3-激酶；VGCC：電壓門控鈣通道；FOS、JUN和Myc：轉(zhuǎn)錄因子；m-m鈣蛋白酶：鈣蛋白酶的同工酶；FOXO：叉頭轉(zhuǎn)錄因子；GSK3：糖原合酶激酶3；TSC2：結(jié)節(jié)性硬化癥2；ASK1：凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1；4EBP1：真核翻譯起始因子4E(eIF4E)結(jié)合蛋白1；S6K1：S6激酶1；PLA2：磷脂酶-A2；TxA2：血栓素A2；SREBP-1：甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1；CREM：cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)蛋白；NF-kB：核因子κ B；Bcl2：B細(xì)胞淋巴瘤2；HO-1：血紅素加氧酶-1；AA：花生四烯酸；RAS：大鼠肉瘤蛋白；STAT：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子；AP1：激活蛋白1；PI3K：磷酸肌醇3-激酶；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶；VDR：維生素D受體；FASN：脂肪酸合酶；ROS：活性氧；CD36：脂肪酸轉(zhuǎn)位酶；SOD：超氧化物歧化酶；ACC：乙酰輔酶A羧化酶；TNF-a：腫瘤壞死因子α；IL-1b：白介素-1b；SCD：硬脂酰-CoA去飽和酶；ELOVL1：ELOV1脂肪酸延伸酶1；ACBP：?；o酶A結(jié)合蛋白；標(biāo)簽：三酰甘油；DAG：二?；视停籔A：磷脂酸；CPT1：肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1；GSH：谷胱甘肽；GSSG：二硫化谷胱甘肽；MDA：丙二醛；NAD：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；TFAM：線粒體轉(zhuǎn)錄因子A。

NDEA和NDMA被認(rèn)為是胰腺致癌物，這表明攝入某些可誘導(dǎo)N-亞硝基化合物產(chǎn)生的食物呈正相關(guān)。這項研究還調(diào)查了飲食中吸煙、維生素C、維生素E或紅肉等因素與胰腺癌發(fā)病率的關(guān)系。值得注意的是，維生素C和E的攝入可以被認(rèn)為是亞硝化抑制劑，而紅肉中血紅素鐵的消耗可能有助于N-亞硝基化合物的內(nèi)源性產(chǎn)生。

己酮可可堿已在實驗嚙齒動物模型中證明了改善N-亞硝胺誘導(dǎo)的肝毒性和氧化應(yīng)激的潛力。N-亞硝胺在損害線粒體脂質(zhì)代謝中的作用仍需要大量研究來調(diào)查藥物中這些雜質(zhì)的確切毒理學(xué)。

3.2.4. 乳腺癌

乳腺癌仍然是世界范圍內(nèi)死亡和發(fā)病的主要原因，通常歸因于不健康的生活方式和飲食習(xí)慣。煙草含有多種亞硝胺，NNK是一種已知促進(jìn)惡性癌細(xì)胞的重要致癌物。這些煙草衍生的致癌物與包括乳腺癌在內(nèi)的各種癌癥的發(fā)展特別相關(guān)。NNK通過與癌細(xì)胞中存在的nAChR相互作用，在乳腺癌的發(fā)展和進(jìn)展中起重要作用。值得注意的是，a9nAChR受體與乳腺癌細(xì)胞的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)。此外，尼古丁和NNK可以與該受體系統(tǒng)相互作用，隨后通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細(xì)胞信號通路如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K-Akt通路來影響癌細(xì)胞增殖。這些信號通路受到尼古丁和雌激素刺激活性的刺激。NNK和尼古丁對a9nAChR的激活通過PI3K-Akt和MAPK信號形成顯著的反饋環(huán)，這可以進(jìn)一步啟動激活蛋白1（AP1）和維生素D受體（VDR）轉(zhuǎn)錄因子刺激，從而賦予癌癥發(fā)展。這種現(xiàn)象已經(jīng)通過使用小干擾RNA(siRNA)對a9nAChR的基因敲除研究得到證實。然而，目前在藥物制劑和API中發(fā)現(xiàn)的亞硝胺雜質(zhì)尚未通過體外和體內(nèi)研究來研究其調(diào)節(jié)a9nAChR促進(jìn)乳腺癌的活性的潛力。

此外，β腎上腺素能受體系統(tǒng)（G蛋白偶聯(lián)受體系統(tǒng)的一部分）及其下游信號在NNK活性上促進(jìn)癌細(xì)胞增殖方面發(fā)揮著重要作用。該信號通路隨后促進(jìn)腺苷酰環(huán)化酶/cAMP/PKA/cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)通路的調(diào)制，而后者又介導(dǎo)EGFR信號通路的反激活。然而，亞硝胺雜質(zhì)對這些G蛋白偶聯(lián)信號通路和EGFR通路的調(diào)制作用尚未通過體外和體內(nèi)研究生動地研究它們在癌癥發(fā)病率中的潛在作用。

3.3.生理改變：血管緊張素受體阻滯劑中的亞硝胺雜質(zhì)

NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDBA和NMBA是已知在生理系統(tǒng)中誘導(dǎo)致癌性的主要亞硝胺。此外，在藥物中發(fā)現(xiàn)的這些雜質(zhì)可能會導(dǎo)致生理系統(tǒng)的改變。例如，氯沙坦、纈沙坦、奧美沙坦、厄貝沙坦和替米沙坦等血管緊張素受體阻滯劑（ARB）已從美國市場召回，原因是其產(chǎn)品中亞硝胺雜質(zhì)水平升高，可能會破壞生理穩(wěn)態(tài)。這些亞硝胺的存在ARBs主要歸因于生產(chǎn)工藝不當(dāng)。

NMDA在人類肝微粒體中由P450 2E1代謝[20]。甲基氧化可誘導(dǎo)α-羥基-NDMA的形成，這是致突變性的，可同時分解并產(chǎn)生兩種活性物質(zhì)，包括甲醛和甲基重氮氫氧化物。這兩種代謝物可能對生理系統(tǒng)有顯著影響[108]。在NDEA的情況下，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的代謝激活由P450 2E1和P450 2A6深刻介導(dǎo)。乙基重氮氫氧化物由P-450介導(dǎo)的NDEA羥基化形成，其進(jìn)一步形成乙基重氮，其可以與DNA相互作用并誘導(dǎo)DNA加合物的形成。DNA的形成會導(dǎo)致人體組織中健康細(xì)胞的生理學(xué)發(fā)生顯著改變通過致癌作用轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞。與NDEA作用相關(guān)的嚙齒動物研究描述了幾種肝癌、食道癌和鼻咽癌的發(fā)病率，因為毒性代謝物誘導(dǎo)了生理改變和致癌性。

當(dāng)與從人體組織獲得的食管細(xì)胞培養(yǎng)物孵育時，NDMA誘導(dǎo)的DNA加合物，如O6-甲基鳥嘌呤（O6-Me-Gua）和N7Me-Gua。在人體組織中觀察到的甲基化DNA加合物通常會損害健康細(xì)胞。在肝細(xì)胞DNA的情況下，觀察到NDMA中毒受害者、O6-Me-Gua和N7-Me-Gua的形成。在NMEA的情況下，N7-Me-Gua是基本上在肝區(qū)和腎區(qū)形成的DNA加合物的甲基化形式，然后是食道和肺。這些毒性DNA加合物可能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上進(jìn)一步損害細(xì)胞蛋白質(zhì)的形成，這需要大量的未來研究來揭示這些N-亞硝基化合物誘導(dǎo)的生理改變背后的潛在機(jī)制。

 

4.增強(qiáng)亞硝胺雜質(zhì)靈敏檢測的分析技術(shù)

多年來，藥品中一直有亞硝胺雜質(zhì)的報道。然而，仍有許多含有這些雜質(zhì)的產(chǎn)品尚未被徹底探索。最近藥品退出市場的激增引起了全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)的極大關(guān)注。作為回應(yīng)，美國食品藥品監(jiān)督管理局（U.S.FDA）、歐洲藥品管理局（EMA）、世界衛(wèi)生組織（WHO）等監(jiān)管機(jī)構(gòu)敦促所有相關(guān)利益相關(guān)者對這些雜質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格的識別和報告，并建議API和藥品制造商開發(fā)高靈敏度的分析方法，特別是能夠定量下限（LOQ）水平的亞硝胺的氣相色譜和液相色譜方法。這對于有效檢測和定量原料藥、藥物合成中間體和藥品成品中痕量水平的這些雜質(zhì)至關(guān)重要，最終確保消費者的藥品安全。開發(fā)這種新穎而靈敏的方法是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，需要大量的專業(yè)知識和研究經(jīng)驗。分析方法開發(fā)中的主要挑戰(zhàn)可能來自分析物電離不足和基質(zhì)干擾等問題。當(dāng)涉及到NDSRIs時，較低的分子量、結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及缺乏現(xiàn)成的標(biāo)準(zhǔn)可能會給實現(xiàn)靈敏檢測帶來困難。它還需要使用高成本儀器，包括液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)。

LC-MS/MS和GC-MS技術(shù)廣泛用于亞硝胺檢測，因為它們在納克級亞硝胺檢測中具有良好的靈敏度。軌道阱和四極桿飛行時間(Q-TOF)分析儀優(yōu)選用于這些雜質(zhì)的痕量水平檢測。USP的倡議“亞硝胺交流”為行業(yè)專家、研究人員和藥品制造商提供了亞硝胺檢測色譜技術(shù)的最新進(jìn)展。靈敏的分析方法應(yīng)能夠?qū)⒛承┗|(zhì)（API或藥品）中的特定亞硝胺雜質(zhì)定量至該特定亞硝胺雜質(zhì)可接受攝入量限度的10%。

GC-MS/MS是鑒定和定量揮發(fā)性和半揮發(fā)性分析物的優(yōu)選分析工具。與電子碰撞電離相比，化學(xué)電離為亞硝胺雜質(zhì)的分析提供了更好的特異性和靈敏度。用于亞硝胺分析的GC-MS/MS中使用的固定相包括聚乙二醇（PEG）涂覆的毛細(xì)管柱、氰丙基苯基二甲基聚硅氧烷和苯基甲基聚硅氧烷。用于亞硝胺分析的幾種檢測器包括火焰離子化檢測器、氮磷檢測器（NPD）和化學(xué)發(fā)光檢測器。GC-MS/MS分析可能會受到殘留溶劑的潛在干擾，這可能會影響分析方法的耐用性和靈敏度，例如，二甲雙胍中NDMA分析中的二甲基甲酰胺（DMF）干擾。來自復(fù)雜基質(zhì)的干擾可以通過額外的凈化和預(yù)處理步驟來克服，如固相萃?。⊿PE）或液液萃?。↙LE），以及使用內(nèi)標(biāo)?？刂坪蜏p輕基質(zhì)的共洗脫至關(guān)重要，因為它會導(dǎo)致假陽性結(jié)果，縮短氣相色譜柱的壽命，并污染質(zhì)譜儀。這個問題可以通過使用頂空（HS）注射模式來克服。然而，HS進(jìn)樣模式不適用于二甲雙胍和雷尼替丁等不耐熱分析物的分析。

GC-MS/MS分析中采用的其他替代方法包括無溶劑HS-GC/MS和全蒸發(fā)HS-GC/MS，其靈敏度高于HS-GC/MS。采購昂貴的同位素內(nèi)標(biāo)的負(fù)擔(dān)可以通過使用諸如HS-GC/MS、HS-固相微萃取(SPME)-GC/MS、分散液液微萃取(DLLME)-GC/MS和具有氮磷檢測的全蒸發(fā)靜態(tài)HS氣相色譜法等方法來克服，這些方法不需要使用內(nèi)標(biāo)。

LC-MS/MS是鑒定和定量極性、非極性和非揮發(fā)性分析物的優(yōu)選分析工具[135]。李等人。指出，與電噴霧電離（ESI）相比，大氣壓化學(xué)電離（APCI）對亞硝胺分析具有更高的靈敏度。ESI是分析N-亞硝基二丙胺（NDPA）的首選。通過使用大氣壓光電離（APPI）可以最小化來自基質(zhì)的干擾。正電離模式適用于大多數(shù)亞硝胺，而負(fù)電離模式在NMBA的情況下是優(yōu)選的。由于二甲雙胍和雷尼替丁的熱不穩(wěn)定性質(zhì)，美國FDA建議使用LC-MS/MS分析它們。氘化同位素標(biāo)準(zhǔn)品通常用于LC-MS/MS分析。LC-MS/MS分析還涉及樣品制備步驟。LLE比SPE更具成本效益。二氯甲烷是NDMA分析的優(yōu)選提取溶劑。LC-MS/MS中的基質(zhì)干擾可以通過在線分流閥來克服，該分流閥繞過樣品中存在的基質(zhì)。

在這篇系統(tǒng)綜述中，我們努力總結(jié)了分析方法的最新進(jìn)展，特別是氣相色譜和液相色譜方法，用于測試原料藥和藥品中的亞硝胺。這份全面的總結(jié)旨在為有興趣開發(fā)更靈敏的方法來檢測各種藥物中亞硝胺的研究人員提供有價值的見解。表S1列出了監(jiān)管機(jī)構(gòu)、獨立研究人員和行業(yè)專家推薦用于亞硝胺分析的LC-MS/MS、GC-MS/MS和HPLC方法。

 

5.亞硝胺雜質(zhì)的監(jiān)管更新

2018年年中，沙坦類原料藥中的NDMA開始首次檢測到亞硝胺，這促使從市場。國際監(jiān)管機(jī)構(gòu)，如美國FDA、EMA、歐洲藥品和醫(yī)療保健質(zhì)量管理局(EDQM)、健康科學(xué)管理局（HAS，新加坡）、藥品和醫(yī)療器械局（PMDA，日本）、治療用品管理局（TGA，澳大利亞）和加拿大衛(wèi)生部（HC，加拿大）合作向API制造商發(fā)出警報。他們提出了幾項法規(guī)、建議和指南來審查其制造工藝，并啟動有關(guān)亞硝胺形成的風(fēng)險評估。主要重點是評估API制造中使用的原材料、中間體、溶劑和試劑是否存在易損胺。2018年，纈沙坦產(chǎn)品被召回市場。2019年，雷尼替丁、尼扎替丁和二甲雙胍緩釋產(chǎn)品被發(fā)現(xiàn)含有亞硝胺，導(dǎo)致其于2020年從市場上召回。雷尼替丁產(chǎn)品中亞硝胺水平升高的根本原因與儲存條件有關(guān)。隨后，注意力轉(zhuǎn)移到檢查可能導(dǎo)致藥品中亞硝胺形成的關(guān)鍵因素上。

 

監(jiān)管機(jī)構(gòu)希望制造商進(jìn)行根本原因分析，以確定亞硝胺是如何摻入藥物和藥品中的。美國FDA提出了三步緩解策略，以控制和防止原料藥和藥品中亞硝胺的形成。第一步，制造商應(yīng)優(yōu)先考慮其API和藥品組合的風(fēng)險評估，并且必須在2021年3月31日之前記錄并向監(jiān)管機(jī)構(gòu)報告其調(diào)查結(jié)果（美國FDA）。EMA給出了2021年3月31日（化學(xué)藥物）和2021年7月1日（生物藥物）的時間表。第2步，在2023年10月1日（美國FDA）、化學(xué)藥物2022年9月26日和生物藥物2023年7月1日之前，必須使用敏感分析技術(shù)定量亞硝胺的確證性測試。第3步，制造商必須報告確定的亞硝胺形成的根本原因，并實施對其工藝或方法的改變以消除亞硝胺形成。

 

2020年，Lhasa有限公司（英國）啟動了藥品制造中使用的輔料中亞硝酸鹽含量數(shù)據(jù)庫的創(chuàng)建。這一舉措涉及行業(yè)專家和研究人員的代表，因為輔料中的亞硝酸鹽含量使藥品更容易含有亞硝胺雜質(zhì)。此外，2020年，由EMA組成的人用藥品委員會（CHMP）對整個情況進(jìn)行了科學(xué)審查，并提交了這方面的報告。2021年，歐洲藥品監(jiān)管網(wǎng)絡(luò)成立了一個名為“亞硝胺實施監(jiān)督小組”的智囊團(tuán)，討論亞硝胺雜質(zhì)出現(xiàn)的發(fā)展和當(dāng)前情況。EMA要求沙坦類、利福平、雷尼替丁、含二甲雙胍和伐尼克蘭藥物的上市許可持有人只有在嚴(yán)格測試后才能將其產(chǎn)品投放市場。

 

美國FDA主要建議遵循三步緩解策略的步驟2和3，以應(yīng)對NDSRI問題的出現(xiàn)。他們還呼吁所有相關(guān)利益攸關(guān)方審查、討論、提供信息并更新他們的建議和方法，以便監(jiān)管機(jī)構(gòu)有效解決這一問題。最近在幾種產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的亞硝胺以及隨后的召回只是冰山一角。未來幾天，市場上已經(jīng)有許多產(chǎn)品的發(fā)病率和風(fēng)險可能會更高。為了應(yīng)對這一潛在危機(jī)，應(yīng)與所有全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)合作成立一個聯(lián)合工作組，旨在制定應(yīng)對即將到來的危機(jī)的戰(zhàn)略。

 

6.亞硝胺風(fēng)險評估和減少亞硝胺雜質(zhì)摻入藥品的重新改良制劑策略

 

如果在初始分析中報告了亞硝胺，則必須對亞硝胺摻入來源進(jìn)行根本原因分析。隨后，必須設(shè)計重新配制策略，以最大限度地降低藥品中亞硝胺雜質(zhì)形成的風(fēng)險。研究減少藥品中亞硝胺的重新配制策略將非常有利于解決亞硝胺引起的危機(jī)。

 

美國FDA建議加入抗壞血酸和α-生育酚等抗氧化劑，因為它們已顯示出抑制人體內(nèi)亞硝胺產(chǎn)生的潛力。此外，使用碳酸鈉等賦形劑在體內(nèi)創(chuàng)造堿性pH環(huán)境，可能是一種有效的緩解策略，因為亞硝胺的產(chǎn)生主要發(fā)生在酸性介質(zhì)中。這種重新配制策略可以設(shè)計并建議給各個制藥行業(yè)的配方設(shè)計師，也可以通過配方設(shè)計師提交的補(bǔ)充或修正傳達(dá)給監(jiān)管機(jī)構(gòu)。

在API多步合成過程以及藥品儲存和運輸過程中，亞硝胺可以通過多種途徑摻入藥品中。在API合成的背景下，含有易損胺的藥物特別容易受到亞硝胺污染。在這種情況下，API制造商在為多步合成過程選擇催化劑、試劑和溶劑時應(yīng)采取細(xì)致的方法。

在多步API合成過程中，加入額外的純化步驟可以有效消除亞硝胺的形成。建議在合成過程中避免使用含有伯胺或仲胺以及亞硝化劑和溶劑的試劑。在評估藥品中亞硝胺污染的風(fēng)險時，需要考慮各種因素，如制劑的pH值、水分含量和粒度分布。還應(yīng)考慮制劑中使用的藥物內(nèi)包裝材料和輔料的材料特性。例如，封蓋箔中的起泡材料或底漆(例如硝化纖維素)的選擇可能是關(guān)鍵的。當(dāng)暴露于二甲胺和二乙胺等仲胺時，硝化纖維素可以充當(dāng)亞硝化劑，所述仲胺可能存在于印刷油墨中。在通常在高溫下進(jìn)行的起泡過程中，任何形成的亞硝胺都可能蒸發(fā)并可能進(jìn)入藥品。儲存條件也可能影響亞硝胺的形成。例如，雷尼替丁API和成品中NDMA的水平會隨著儲存溫度的升高而增加。為了緩解這一點，Harmon等人提出了除氧包裝技術(shù)來對抗自氧化，這是鹽酸雷尼替丁中NDMA形成的一種可能機(jī)制。Harmon等人還提出，各種賦形劑的成分甲醛催化亞硝化反應(yīng)并導(dǎo)致亞硝胺的形成。制造商在為其配方選擇輔料時應(yīng)謹(jǐn)慎，特別是考慮輔料中的亞硝酸鹽含量。當(dāng)原料藥和藥品中含有易受攻擊的胺時，這一點尤其重要。此外，在藥品風(fēng)險評估中，還應(yīng)考慮彈性成分。在藥品儲存的情況下，應(yīng)仔細(xì)評估儲存溫度。圖5描繪了減輕亞硝胺雜質(zhì)摻入藥物產(chǎn)品中的重新配制策略。

圖5:減少亞硝胺雜質(zhì)摻入藥品的重新配制策略。API：活性藥物成分

 

7:結(jié)論

該綜述提供了與亞硝胺雜質(zhì)相關(guān)的分子毒性的生動精確的風(fēng)險評估，能夠進(jìn)行有效的根本原因分析和重新配制策略，以減少其在藥品中的存在。高靈敏度分析方法的發(fā)展簡化了這些雜質(zhì)的檢測過程。此外，監(jiān)管機(jī)構(gòu)和科學(xué)界采取積極措施對于解決藥品中潛在的亞硝胺雜質(zhì)相關(guān)問題至關(guān)重要。這種方法確保了患者的安全，并培養(yǎng)了對各種疾病反復(fù)使用藥物的信心。

 

藥品、賦形劑和API中N-亞硝基化合物，特別是N-亞硝胺的存在，由于其遺傳毒性和誘變作用，對人類健康構(gòu)成重大風(fēng)險。強(qiáng)調(diào)毒理學(xué)數(shù)據(jù)，設(shè)計有效的方法來計算可接受的攝入量限制和探索結(jié)構(gòu)活性關(guān)系，可以大大有助于解決亞硝胺的危機(jī)。全球相關(guān)利益攸關(guān)方和專家分享關(guān)于亞硝胺的計算機(jī)預(yù)測、體內(nèi)研究和分析測試的知識也可以極大地幫助避免重復(fù)測試和降低成本。綜述展示了亞硝胺雜質(zhì)對生理系統(tǒng)的有害影響，強(qiáng)調(diào)了新型分析策略對靈敏檢測和定量的重要性。此外，該綜述強(qiáng)調(diào)了這樣一個假設(shè)，即了解根本原因、實施重新改良制劑策略和納入監(jiān)管更新可以有效減少藥物配方中的亞硝胺雜質(zhì)，確保開發(fā)更安全的產(chǎn)品。