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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-07-06 20:06
摘 要 / Abstract
致癌性試驗(yàn)是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容之一。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外普遍采用并認(rèn)可基于ICHS1B 指南建立的藥物非臨床致癌性試驗(yàn)替代方案。遺傳修飾致癌性小鼠模型是替代方案中“卡脖子”的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。從1997 年ICH S1B 指南發(fā)布至今，我國(guó)制藥行業(yè)主要依賴進(jìn)口獲得小鼠模型，其價(jià)格高昂、進(jìn)口周期長(zhǎng)、條件嚴(yán)苛，且由于模型資源唯一，制藥行業(yè)承受著成本高昂和供應(yīng)鏈不穩(wěn)的雙重壓力。本文概述了國(guó)內(nèi)外致癌性試驗(yàn)相關(guān)指導(dǎo)原則，介紹了國(guó)內(nèi)外主要的致癌性小鼠模型，包括Tg.rasH2、KI.C57-ras、p53+/- 小鼠等的構(gòu)建、驗(yàn)證與應(yīng)用歷程，并展望了建立我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的致癌性小鼠模型以及標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)供應(yīng)的途徑。
The assessment of carcinogenicity is a pivotal element in the preclinical safety evaluation of pharmaceuticals. The alternative approach to non-clinical carcinogenicity assessment, as outlined in the ICH S1B guidelines, is widely endorsed both domestically and internationally. However, the development of genetically modified mouse models for carcinogenicity poses significant technical challenges within this alternative approach. Since the issued of the ICH S1B guidelines in 1997, China's pharmaceutical industry has heavily relied on costly and lengthy imports from overseas, which are subject to stringent conditions. Moreover, due to monopolied resources being controlled by Western countries, the pharmaceutical industry faces mounting pressure from high costs and unstable supply chains. This article outlines relevant guidelines for carcinogenicity evaluation at home and abroad, introduces the global development, validation, and application history of major carcinogenicity mouse models such as Tg.rasH2, KI.C57-ras V2.0, p53+/- mice; it also looks ahead to establishing independent intellectual property rights for domestically produced carcinogenicity mouse models while standardizing their production and supply.
關(guān) 鍵 詞 / Key words
藥物致癌性試驗(yàn)；致癌性小鼠模型；指導(dǎo)原則；遺傳修飾動(dòng)物模型
pharmaceutical carcinogenicity test; carcinogenicity mouse model; guidelines; genetically modified animal models
致癌性試驗(yàn)是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)中的重要內(nèi)容， 也是藥物毒理學(xué)研究中的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)， 旨在考察藥物在動(dòng)物體內(nèi)的潛在致癌作用， 從而評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)其可能對(duì)人體造成的危害。國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）發(fā)布的《S1A ：藥物致癌性試驗(yàn)必要性指導(dǎo)原則》（Guideline on the Need for Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals S1A）指出， 臨床預(yù)期用藥6 個(gè)月以上（含6 個(gè)月）或治療慢性復(fù)發(fā)性疾病而需間歇使用的藥物以致總暴露量與前者相似的藥物均需進(jìn)行致癌性試驗(yàn)[1]。傳統(tǒng)的致癌性試驗(yàn)方法框架是通過(guò)為期2 年的大鼠和小鼠的致癌性試驗(yàn)完成的。20 世紀(jì)90 年代開(kāi)始， 歐盟、美國(guó)等國(guó)家和地區(qū)開(kāi)展了遺傳修飾動(dòng)物模型的短期致癌性試驗(yàn)方法的研究。1997 年， ICH 發(fā)布了《S1B ：藥物致癌性試驗(yàn)》（Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals S1B）[2]，建議藥物臨床前致癌性試驗(yàn)采用遺傳修飾動(dòng)物模型開(kāi)展試驗(yàn)，該指導(dǎo)原則中新藥潛在致癌性評(píng)價(jià)改為一項(xiàng)大鼠長(zhǎng)期致癌性試驗(yàn)加上一項(xiàng)短期或中期體內(nèi)試驗(yàn)，使用的模型包括嚙齒類引發(fā)- 促進(jìn)模型、遺傳修飾小鼠模型和新生嚙齒類動(dòng)物致腫瘤模型，以縮短試驗(yàn)周期，減少動(dòng)物用量并降低費(fèi)用。2010 年，我國(guó)發(fā)布實(shí)施《藥物致癌試驗(yàn)必要性的技術(shù)指導(dǎo)原則》，鼓勵(lì)國(guó)內(nèi)制藥企業(yè)開(kāi)展新藥的短期致癌性評(píng)價(jià)試驗(yàn)[3]。
ICH S1B 指導(dǎo)原則中的遺傳修飾小鼠模型一般指Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型、p53+/- 基因敲除小鼠模型、Tg.AC 轉(zhuǎn)基因小鼠模型及Xpa-/-基因敲除小鼠模型[4-5]，其構(gòu)建的方法為傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)（例如Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠）或干細(xì)胞打靶法（例如p53+/- 基因敲除小鼠），但研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在著不足。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展[6]，研究人員利用新型打靶技術(shù)構(gòu)建了多種抑癌基因敲除或原癌基因激活的致癌性小鼠模型。這些新型遺傳修飾小鼠模型與傳統(tǒng)小鼠模型相比，具有動(dòng)物用量少、試驗(yàn)周期短、費(fèi)用低、特異性及敏感性高等多重優(yōu)勢(shì)，為推動(dòng)新藥研發(fā)提供了更實(shí)用的模型工具[7]。
本文從新藥臨床前致癌性試驗(yàn)方法進(jìn)展、國(guó)內(nèi)外致癌性試驗(yàn)相關(guān)指導(dǎo)原則的發(fā)布及現(xiàn)有致癌性小鼠模型的建立等3 個(gè)方面概述了遺傳修飾動(dòng)物模型在致癌性試驗(yàn)中的應(yīng)用，以探索建立我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的致癌性小鼠模型的途徑。
1、新藥臨床前致癌性試驗(yàn)方法進(jìn)展
近年來(lái)，新藥致癌性試驗(yàn)技術(shù)方法不斷更新和完善。致癌性試驗(yàn)主要包括體外試驗(yàn)、體內(nèi)試驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查等方面。體內(nèi)試驗(yàn)是藥物毒理學(xué)評(píng)價(jià)的重要環(huán)節(jié)，尤其是動(dòng)物模型的優(yōu)化和新型動(dòng)物模型的建立，為致癌性試驗(yàn)方法發(fā)展提供了更科學(xué)的技術(shù)工具[8]。致癌性試驗(yàn)經(jīng)歷了2 年期大鼠和小鼠致癌性試驗(yàn)和2 年期大鼠和6 個(gè)月小鼠模型替代致癌性試驗(yàn)2 個(gè)發(fā)展階段。2 年期致癌性試驗(yàn)通常選用兩種嚙齒類動(dòng)物（大鼠和小鼠）進(jìn)行評(píng)價(jià)，被視為致癌性試驗(yàn)的“ 黃金標(biāo)準(zhǔn)”。在該致癌性試驗(yàn)的分析中，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer）和美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)計(jì)劃（National Toxicology Program） 都得出結(jié)論， 嚙齒類動(dòng)物2 年期的致癌性試驗(yàn)結(jié)果與人類真實(shí)致癌反應(yīng)高度一致[9-10]。雖然也存在局限性[11-12]， 但美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）、美國(guó)環(huán)境保護(hù)局（Environmental Protection Agency，EPA） 和全球其他國(guó)家和地區(qū)的相關(guān)監(jiān)管機(jī)構(gòu)均接受了2 年期致癌性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步考慮到致癌性試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、成本高的客觀現(xiàn)實(shí)，通常建議在Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)完成后進(jìn)行致癌性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。6個(gè)月替代致癌性試驗(yàn)是1997 年ICH S1B 指導(dǎo)原則中正式提出的新評(píng)價(jià)框架，即選用一種常規(guī)嚙齒類動(dòng)物（大鼠）和一種嚙齒類動(dòng)物替代模型（多指致癌性遺傳修飾小鼠模型）進(jìn)行致癌性試驗(yàn)，同時(shí)強(qiáng)調(diào)使用證據(jù)權(quán)重（weight of evidence，WoE） 對(duì)藥物的致癌性信息和試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行總體風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[2]。其中選用的小鼠替代模型是在20 世紀(jì)80 年代~90年代由多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的科學(xué)家們構(gòu)建并聯(lián)合驗(yàn)證的、針對(duì)不同致癌基因或抑癌基因編輯產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠模型。近年來(lái)，短期致癌性試驗(yàn)方法成為美國(guó)、日本、歐盟等國(guó)家和地區(qū)的藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)普遍認(rèn)可并接受的新藥申報(bào)方法[13]。
替代性毒理學(xué)新技術(shù)在一定范圍內(nèi)興起和發(fā)展，包括體外方法、計(jì)算機(jī)模擬、毒理基因組學(xué)等，尤其是器官芯片技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了非遺傳毒性藥物的致癌性預(yù)測(cè)和致癌機(jī)制研究[14-15]。雖然，多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)已認(rèn)識(shí)到毒理基因組學(xué)在藥物研發(fā)中的重要性，但如何準(zhǔn)確評(píng)價(jià)器官芯片的性能、推動(dòng)其從藥物研發(fā)到注冊(cè)及監(jiān)管的應(yīng)用仍面臨諸多問(wèn)題[16]。
可以預(yù)計(jì)，未來(lái)研究人員將會(huì)繼續(xù)關(guān)注和發(fā)展新的致癌性試驗(yàn)替代方法，但基于體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)價(jià)新藥潛在致癌性風(fēng)險(xiǎn)還是必要的。
2、國(guó)內(nèi)外致癌性試驗(yàn)相關(guān)指導(dǎo)原則的建立
2.1 國(guó)外致癌性試驗(yàn)相關(guān)指導(dǎo)原則
全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)和組織，包括ICH、FDA、EMA 等已經(jīng)制定并實(shí)施了致癌性試驗(yàn)指導(dǎo)原則， 已形成了成熟的致癌性試驗(yàn)評(píng)價(jià)體系。1995 年，ICH 陸續(xù)推出了S1A、S1B、S1C 系列技術(shù)指導(dǎo)原則。隨后，F(xiàn)DA 發(fā)布了《嚙齒類動(dòng)物致癌性試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)考慮》（Statistical Aspects of the Design, Analysis, and Interpretation of Chronic Rodent Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals） 及《致癌性試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的提交》（Carcinogenicity Study Protocol Submissions）等技術(shù)指導(dǎo)原則。FDA 發(fā)布的《神經(jīng)毒性研究紅皮書(shū)》（Redbook 2000: IV.C.10.Neurotoxicity Studies）作為實(shí)用性很強(qiáng)的指導(dǎo)方針， 以草案形式提供了關(guān)于設(shè)計(jì)和開(kāi)展致癌性評(píng)價(jià)的具體方法。不過(guò)，《神經(jīng)毒性研究紅皮書(shū)》中提供的研究設(shè)計(jì)被認(rèn)為是最基本的設(shè)計(jì)， 實(shí)用性略欠缺。EMA 發(fā)布的《人類胰島素類似物致癌潛力的非臨床評(píng)估科學(xué)指南》（Non-Clinical Assessment of the Carcinogenic Potential of Human Insulin Analogues – Scientific Guideline）、《CHMP SWP 關(guān)于使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型開(kāi)展致癌性試驗(yàn)的結(jié)論和建議科學(xué)指南》（CHMP SWP Conclusions and Recommendations on the Use of Genetically Modified Animal Models for Carcinogenicity Assessment -Scientific Guideline）、《治療HI V感染的藥品致癌性評(píng)價(jià)指南》（Carcinogenicity Evaluation of Medicinal Products for the Treatment of HIV Infection -Scientific Guideline）指導(dǎo)原則中也提出了藥物潛在致癌性試驗(yàn)的注解。這些致癌性試驗(yàn)指導(dǎo)原則內(nèi)容涵蓋了致癌性試驗(yàn)設(shè)計(jì)、開(kāi)展的必要性、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、考慮要點(diǎn)、劑量選擇等方面。2022 年，ICH 再次發(fā)布了《S1B（R1）：藥物致癌性試驗(yàn)》[Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals S1B (R1)] 附錄，該指導(dǎo)原則再次強(qiáng)調(diào)了3R 原則（the rules of 3R），提出了WoE方法評(píng)估2 年期大鼠的致癌性試驗(yàn)的價(jià)值，但該指導(dǎo)原則仍推薦開(kāi)展小鼠致癌性試驗(yàn)，可見(jiàn)遺傳修飾的致癌性小鼠模型的應(yīng)用價(jià)值。S1B（R1）指導(dǎo)原則附錄的發(fā)布，既減少了動(dòng)物的使用，將資源集中到更加科學(xué)的、基于機(jī)制的致癌性試驗(yàn)上，同時(shí)持續(xù)推進(jìn)創(chuàng)新藥安全并合乎倫理的研發(fā)。
2.2 我國(guó)致癌性試驗(yàn)相關(guān)指導(dǎo)原則
我國(guó)在藥物致癌性試驗(yàn)領(lǐng)域起步較晚，近些年先后也發(fā)布了一系列的法規(guī)和指導(dǎo)原則，已經(jīng)初步搭建了致癌性試驗(yàn)管理體系。2005 年版《藥品注冊(cè)管理辦法》附件中規(guī)定預(yù)期臨床連續(xù)用藥6個(gè)月以上或需經(jīng)常間歇使用的藥物必須提供致癌性試驗(yàn)資料，并指出了進(jìn)行致癌性試驗(yàn)的多個(gè)考慮因素。2007 年，《治療用生物制品非臨床安全性技術(shù)審評(píng)一般原則》發(fā)布，闡述了相關(guān)產(chǎn)品致癌性試驗(yàn)的要求。2009 年， 原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心組織毒理專家、企業(yè)及研究單位代表召開(kāi)了制定“藥物致癌試驗(yàn)必要性技術(shù)指導(dǎo)原則”專題討論會(huì)，會(huì)上基本認(rèn)同了ICHS1A 中內(nèi)容的適用性，并結(jié)合我國(guó)國(guó)情進(jìn)行了調(diào)整，《藥物致癌試驗(yàn)必要性的技術(shù)指導(dǎo)原則》于2010 年4 月1 日發(fā)布。該指導(dǎo)原則旨在闡明在何種情況下需要進(jìn)行藥物致癌性試驗(yàn)，以及進(jìn)行致癌性試驗(yàn)的考慮因素和致癌性試驗(yàn)的時(shí)間安排等。該指導(dǎo)原則的發(fā)布意味著我國(guó)開(kāi)展新藥致癌性試驗(yàn)的工作進(jìn)入新階段。
2017 年6 月，原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局成為ICH 成員，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)藥品科學(xué)監(jiān)管與國(guó)際接軌，隨后專門成立了ICH 工作辦公室，主要負(fù)責(zé)ICH 指導(dǎo)原則的轉(zhuǎn)化實(shí)施。目前，國(guó)家藥品監(jiān)管部門陸續(xù)發(fā)布多項(xiàng)ICH 指導(dǎo)原則及其中文譯稿，我國(guó)開(kāi)始全面實(shí)施ICH 指導(dǎo)原則。2019 年，《S1A ：藥物致癌性試驗(yàn)必要性指導(dǎo)原則》發(fā)布，成為第一個(gè)轉(zhuǎn)化的指導(dǎo)原則。2022 年，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心發(fā)布了《關(guān)于公開(kāi)征求ICH〈S1B（R1）：致癌性研究〉實(shí)施建議和中文版的通知》，持續(xù)推動(dòng)新修訂的ICH 致癌性試驗(yàn)指導(dǎo)原則在我國(guó)實(shí)施。綜上，本文對(duì)國(guó)內(nèi)外致癌性試驗(yàn)指導(dǎo)原則及指導(dǎo)用書(shū)進(jìn)行了總結(jié)，見(jiàn)表1。
3、國(guó)內(nèi)外致癌性試驗(yàn)用遺傳修飾動(dòng)物模型
遺傳修飾動(dòng)物模型是建立藥物致癌性試驗(yàn)替代方法的關(guān)鍵技術(shù)，對(duì)我國(guó)制藥企業(yè)而言，也是一項(xiàng)“卡脖子”的技術(shù)。為此，本文將重點(diǎn)介紹國(guó)內(nèi)外代表性遺傳修飾動(dòng)物模型的構(gòu)建歷程、各自優(yōu)缺點(diǎn)以及真實(shí)世界研究的應(yīng)用，并對(duì)我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的致癌性小鼠模型的構(gòu)建進(jìn)行了討論。
3.1 國(guó)外遺傳修飾動(dòng)物模型
20 世紀(jì)80 年代出現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因技術(shù)，自此，通過(guò)基因編輯技術(shù)建立的遺傳修飾大小鼠模型廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域，包括潛在致癌性試驗(yàn)。常見(jiàn)的遺傳修飾小鼠模型包括Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型、p53+/- 基因敲除小鼠模型、Tg.AC 轉(zhuǎn)基因小鼠模型以及Xpa-/-基因敲除小鼠模型。
為驗(yàn)證4 種替代小鼠模型的準(zhǔn)確性和靈敏性，1996~2001年國(guó)際生命科學(xué)研究所（International Life Sciences Institute，ILSI） 和健康與環(huán)境科學(xué)研究所（Health and Environmental Sciences Institute，HESI）協(xié)調(diào)美國(guó)、歐盟和日本等國(guó)家和地區(qū)的50 多家制藥企業(yè)、政府部門和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了小鼠模型的系統(tǒng)評(píng)估工作，耗費(fèi)近3500 萬(wàn)美元。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)定實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)現(xiàn)了跨多個(gè)實(shí)驗(yàn)室獲得的數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和可比性[27]。其間，共完成了包含N-甲基-N-亞硝基脲（MNU）、p-3-氨基對(duì)甲苯甲醚、12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13等 21 個(gè)已知致癌受試物的致癌性實(shí)驗(yàn)，雖然有個(gè)別實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不確定，但最終認(rèn)為Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型和雜合p53+/- 基因敲除小鼠模型可用于短期致癌性試驗(yàn)評(píng)價(jià)，Tg.AC 轉(zhuǎn)基因小鼠模型和純合Xpa-/- 基因敲除小鼠模型存在一定的試驗(yàn)評(píng)價(jià)風(fēng)險(xiǎn)[28-29]。本文對(duì)國(guó)外常見(jiàn)的4 種小鼠模型的特性進(jìn)行了比較，見(jiàn)表2。在2010 年后提交給FDA 的新藥申報(bào)中，未見(jiàn)采用雜合p53+/- 基因敲除小鼠模型用于致癌性試驗(yàn)評(píng)價(jià)，目前使用最為廣泛的模型是Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型，故本文對(duì)Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行了重點(diǎn)介紹。
3.1.1 Tg.AC 轉(zhuǎn)基因小鼠模型
Tg.AC 轉(zhuǎn)基因小鼠模型是美國(guó)科學(xué)家Leder 等人在1990年構(gòu)建，采用原核注射的方法將活化的人源v-Ha-ras 基因?qū)氲紽VB/N 小鼠品系中產(chǎn)生，該小鼠模型最顯著的特征是在表皮磨損區(qū)域或誘導(dǎo)后短期內(nèi)會(huì)出現(xiàn)乳頭狀瘤， 曾用于經(jīng)皮給藥藥物致癌性試驗(yàn)的替代模型[30-33]。ILSI/HESI 項(xiàng)目中早期使用純合子Tg.AC 轉(zhuǎn)基因小鼠， 后期則使用雜合子Tg.AC 轉(zhuǎn)基因小鼠。Tg.AC 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建，是將珠蛋白啟動(dòng)子與v-Ha-ras 基因連接，通過(guò)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組DNA 隨機(jī)整合進(jìn)入小鼠基因組。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的天生不足可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因遺傳不穩(wěn)定，基因可能會(huì)丟失，從而導(dǎo)致該小鼠對(duì)致癌物不敏感，不能較好地反映已知人類陽(yáng)性致癌物的致癌性。早期Tg.AC 轉(zhuǎn)基因小鼠模型可用于局部給藥和用于人類局部使用的化合物的致癌性試驗(yàn)，由于其準(zhǔn)確性和敏感性方面缺陷，目前為其他模型取代，F(xiàn)DA 不再推薦使用這種模型 [34]。
3.1.2 Xpa-/- 基因敲除小鼠模型
Xpa-/- 基因敲除小鼠模型是美國(guó)科學(xué)家在1995 年構(gòu)建，采用胚胎干細(xì)胞（embryonic stemcell，ES）打靶技術(shù)將小鼠Xpa基因的3–4 號(hào)外顯子敲除，從而獲得Xpa 基因敲除小鼠。Xpa-/-基因敲除小鼠易受紫外線誘導(dǎo)產(chǎn)生皮膚和眼部腫瘤，并可在二羥甲基丁酸化學(xué)誘導(dǎo)后發(fā)生皮膚腫瘤[35]。ILSI/HESI 項(xiàng)目中關(guān)于Xpa-/- 基因敲除小鼠模型數(shù)據(jù)較少，僅有13/21 個(gè)化合物采用該模型評(píng)價(jià)，且無(wú)重復(fù)試驗(yàn)，特別是3 個(gè)人類遺傳毒性致癌物中的2 個(gè)化合物美法侖和環(huán)磷酰胺均未采用該模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，故尚無(wú)法對(duì)該模型的價(jià)值作出最終判斷，純合Xpa-/- 基因敲除小鼠與癌癥易感性增加最相關(guān)的是全基因組修復(fù)缺陷，而不是轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)（transcription-coupled repair，TCR）缺陷。純合Xpa-/- 基因敲除小鼠存在TCR 介導(dǎo)的活性轉(zhuǎn)錄基因中基因毒性損傷缺陷，從而導(dǎo)致對(duì)化合物的敏感性增強(qiáng)，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，故不推薦使用[34]。
3.1.3 p53+/- 基因敲除小鼠模型
p53+/- 基因敲除小鼠模型是美國(guó)科學(xué)家在1992 年構(gòu)建[36]，采用ES 打靶技術(shù)敲除小鼠p53抑癌基因的5 號(hào)外顯子，通過(guò)顯微注射將重組ES 送入129 受體鼠的囊胚胚泡中，并將胚泡植入假孕的 F1（C57BL/6.CBA）雌性小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生嵌合型小鼠。嵌合體多表現(xiàn)為129 ES 遺傳特性，隨后將嵌合體雄性與 C57BL/ 6雌性小鼠交配。在第四代回交后，約有6% 的 129 品系等位基因被保留下來(lái)，故準(zhǔn)確名稱應(yīng)表示為B6.129-Trp53（N4）[37]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該模型對(duì)遺傳毒性致癌物敏感，僅可用于遺傳毒性藥物潛在致癌性試驗(yàn)[28，38]，后續(xù)使用逐漸減少。
3.1.4 Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型
Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型是由日本科學(xué)家在1990 年通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法將人原癌基因c-Ha-ras基因轉(zhuǎn)入小鼠篩選獲得，該轉(zhuǎn)入基因是通過(guò)將膀胱癌和黑色素瘤患者激活突變的c-Ha-ras 進(jìn)行重組連接獲得， 僅最后一個(gè)內(nèi)含子有突變， 保留c-Ha-ras 基因內(nèi)源性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子， 如圖1 所示[39-41]。
另外， 該模型是在DBA/2 和C57BL/6J 小鼠品系的雜交胚中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，產(chǎn)生并獲得了8 只首建鼠，其中2 只存活。初步比較后，最終選擇其中2 系作為模型的首建鼠，并將首建鼠與C57BL/6J 品系進(jìn)行超過(guò)10 代的回交，使其與C57BL/6J 回交純度達(dá)到99.5%后開(kāi)始大規(guī)模生產(chǎn)，目前使用的為C57BL/6J 品系的Tg.rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠模型[42-44]。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法證實(shí)，該模型一共轉(zhuǎn)入3 個(gè)拷貝基因，并在15 號(hào)染色體E3 區(qū)以首尾串聯(lián)方式排列[45]。為降低自發(fā)腫瘤發(fā)生率，實(shí)際致癌性試驗(yàn)使用的是Tg.rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠與BALB/cByJ 小鼠的雜交一代，命名為CB6F1 雜合小鼠。Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因同窩小鼠的生長(zhǎng)曲線，如圖2 所示， 其中雄性Tg.rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠的絕對(duì)體重為野生的80%， 雌性Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠的絕對(duì)體重為野生的 90%，但臟體比與野生型相似[46]。
值得一提的是，Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型是隨機(jī)插入方式構(gòu)建，插入到E3 位點(diǎn)、插入3 個(gè)拷貝、呈首尾串聯(lián)方式排列，均是在生物體內(nèi)自發(fā)發(fā)生的隨機(jī)事件。但這些因素均會(huì)影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和模型穩(wěn)定性，對(duì)后續(xù)該小鼠模型致癌性表型起到了不可忽視的決定性作用。再次重復(fù)這個(gè)轉(zhuǎn)基因過(guò)程，很難重現(xiàn)同一結(jié)果。
本文對(duì) 12 項(xiàng) ILSI 替代致癌性測(cè)試（ACT）研究項(xiàng)目在 26周用藥期（32 周齡小鼠）內(nèi)觀察到的自發(fā)性腫瘤發(fā)病率和發(fā)病時(shí)間情況進(jìn)行了匯總，見(jiàn)表3。在多數(shù)情況下，常見(jiàn)自發(fā)性腫瘤的發(fā)生率略高于 1.0%[47]。2012 年，美國(guó)輝瑞公司等3 家公司根據(jù)內(nèi)部數(shù)據(jù)和出版文獻(xiàn)等資料整理了Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)性腫瘤發(fā)生率。自發(fā)性腫瘤發(fā)生率大于1.0% 的常見(jiàn)腫瘤中，細(xì)支氣管肺泡腺瘤（平均3.9%~9.9%，范圍0.0%~18%）、細(xì)支氣管肺泡腺癌（ 平均1.4%~2.4%， 范圍0.0%~5.0%）， 脾臟血管肉瘤（ 平均3.0%~ 3.9%， 范圍0.0%~17.0%）， 皮膚鱗狀細(xì)胞乳頭狀瘤（ 平均1.1%~1.2%，范圍0.0%~ 4.0%）、哈德腺腺瘤（ 平均0.8%~1.2%， 范圍0.0%~4.0%） 和肝細(xì)胞腺瘤（ 平均1.8%， 僅雄鼠為0.0%~9.0%）[48]?？傊?， 該自發(fā)性腫瘤發(fā)生率在可以接受的范圍內(nèi)，但也應(yīng)注意，不同實(shí)驗(yàn)室獲得的數(shù)據(jù)存在差異，甚至波動(dòng)很大。此外，應(yīng)注意不同實(shí)驗(yàn)室間自發(fā)性腫瘤計(jì)算方法的差別，比較嚴(yán)格的方法是，不分腫瘤類型，只要有一只小鼠發(fā)生任何一種自發(fā)性腫瘤，均記為陽(yáng)性。
陽(yáng)性致癌物證實(shí)了Tg.rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)遺傳毒性和非遺傳毒性的人類致癌物是敏感的，能識(shí)別廣譜致癌物。根據(jù)傳統(tǒng)2 年期的嚙齒類動(dòng)物的生物試驗(yàn)數(shù)據(jù)，在對(duì)于27 種化學(xué)品進(jìn)行的26 周分析研究中，Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型準(zhǔn)確預(yù)測(cè)了約80% 化學(xué)品的致癌反應(yīng)。以MNU（75mg/kg，腹腔注射） 作為陽(yáng)性對(duì)照物（MNU 是最常用的陽(yáng)性致癌物），Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)陽(yáng)性致癌物比同窩野生型小鼠更敏感的靶器官包括血液系統(tǒng)、胸腺、前胃和皮膚[46，49-50]。近幾年，Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠的研究趨于細(xì)化，多數(shù)研究集中在其背景腫瘤的研究，以期增加該小鼠模型的背景數(shù)據(jù)庫(kù)，提升試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。根據(jù)美國(guó)輝瑞公司2004 年3 月和2009 年7 月在GLP 條件下進(jìn)行的10 項(xiàng)雄鼠和11 項(xiàng)雌鼠為期6 個(gè)月致癌性研究，研究結(jié)果結(jié)合其他研究和文獻(xiàn)報(bào)道，較全面匯總了Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤譜及發(fā)生率，見(jiàn)表4。
3.2 我國(guó)遺傳修飾動(dòng)物模型
目前， 我國(guó)通過(guò)GLP 認(rèn)證的藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)研究機(jī)構(gòu)已70 多家，建立了較為系統(tǒng)和完善的藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)體系，但臨床前藥物致癌性試驗(yàn)體系的建立尚滯后于國(guó)外，缺乏我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的致癌性小鼠模型。從2004 年開(kāi)始，中國(guó)食品藥品檢定研究院（以下簡(jiǎn)稱中檢院）啟動(dòng)了我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的致癌性小鼠模型研究，先后研發(fā)了基于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建的Tg.C57- ras V1.0 版和先進(jìn)干細(xì)胞打靶技術(shù)構(gòu)建的KI.C57- rasV2.0 版兩代致癌性小鼠模型，均已獲得專利授權(quán)，并在國(guó)內(nèi)較廣泛地使用。由于起步工作基礎(chǔ)薄弱，研發(fā)過(guò)程曲折，且研究經(jīng)費(fèi)需求巨大，項(xiàng)目整體進(jìn)展未達(dá)到預(yù)期，研發(fā)經(jīng)歷了長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年。本文將簡(jiǎn)述中檢院兩代致癌性小鼠模型構(gòu)建歷程，總結(jié)得與失，并提出建立我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的致癌性小鼠模型需要著重考慮的要點(diǎn)，以期為后續(xù)研究人員研發(fā)提供參考。
3.2.1 中檢院一代致癌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠模型
中檢院一代致癌性小鼠模型采用與日本Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型相同的轉(zhuǎn)基因方法構(gòu)建，命名為Tg.C57-ras V1.0，轉(zhuǎn)入的人原癌基因c-Ha-ras 含有4 個(gè)外顯子、自身啟動(dòng)子、調(diào)控序列和poly A 信號(hào)序列[51]。經(jīng)原核注射，轉(zhuǎn)基因整合率為1.6%，獲6 只首建鼠，其中3 只成活，最終選擇首建鼠3 進(jìn)行保種繁殖，后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明，其轉(zhuǎn)基因能穩(wěn)定遺傳[52]。插入基因拷貝數(shù)經(jīng)熒光定量PCR方法測(cè)定，拷貝數(shù)為4[53]，但整合位點(diǎn)未確定。
通過(guò)測(cè)定Tg.C57-ras V1.0小鼠的22 項(xiàng)血液生理指標(biāo)和12項(xiàng)血液生化指標(biāo)，比較雌性轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠和陰性鼠發(fā)現(xiàn)，嗜中性粒細(xì)胞（NEUT）、嗜中性粒細(xì)胞百分比（NEUT%）差異顯著（P<0.05） ，血小板壓積（PCT）差異極顯著（ P<0.01），其余19項(xiàng)無(wú)顯著性差異（P>0.05）。雌性陽(yáng)性鼠和陰性鼠的12 項(xiàng)生化指標(biāo)均差異不顯著（P>0.05）；雄性小鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、甘油三酯（TG） 差異顯著（P<0.05），其余10 項(xiàng)差異不顯著（P>0.05）[54-56]。
給予Tg.C57-ras V1.0 小鼠陽(yáng)性致癌物（MNU，75mg/kg），雌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠惡性淋巴瘤的發(fā)生率為14%，比相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道略低，未觀察到皮膚及前胃乳頭狀瘤等特征腫瘤的發(fā)生[57]，雌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠乳腺腺瘤的發(fā)生率為6%，但是雄性Tg.C57-ras V1.0 小鼠發(fā)生直腸纖維肉瘤，未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。
結(jié)合后續(xù)數(shù)量更大且多單位使用結(jié)果顯示， 一代致癌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠較同窩野生型敏感，遺傳穩(wěn)定性好，質(zhì)量可靠。目前，累計(jì)向市場(chǎng)提供近1500 只，用于硝酸鑭、納米銀新型材料的潛在致癌性試驗(yàn)，并支持國(guó)家科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目完成，推動(dòng)了我國(guó)基于轉(zhuǎn)基因小鼠模型的致癌性試驗(yàn)替代方法的建立[58-59]。
通過(guò)對(duì)不同單位的5 個(gè)致癌性試驗(yàn)時(shí)間綜合分析及文獻(xiàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)， 一代致癌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠模型存在較突出的不足，主要表現(xiàn)為敏感性較日本Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠低，尚不能完全達(dá)到文獻(xiàn)報(bào)道的國(guó)際同類模型的效果。這可能是由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身的局限性或其他原因帶來(lái)的，故在2017 年前后，中檢院停止了一代致癌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠模型的生產(chǎn)供應(yīng)，并同步啟動(dòng)更加先進(jìn)的第二代致癌性小鼠模型的研制。
基于多年的探索，雖然一代致癌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠模型存在局限，但為研究人員在致癌性小鼠模型研究中積累了豐富的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)，為二代小鼠模型的遺傳設(shè)計(jì)、生物學(xué)特性鑒定、生產(chǎn)體系及資源保存體系的建立以及規(guī)?；?lián)合驗(yàn)證思路的形成奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，也提示了研究人員基于常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建的遺傳修飾小鼠模型較難達(dá)到預(yù)期效果。
3.2.2 中檢院二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型
基于遺傳學(xué)原理及遺傳修飾小鼠模型的自身特點(diǎn)，研究人員認(rèn)為遺傳修飾動(dòng)物模型的表型受5 方面因素影響：轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)、基因排列順序、插入位點(diǎn)以及小鼠遺傳背景，要想獲得符合預(yù)期的表型，上述因素均需要考慮。中檢院二代致癌性小鼠模型，是在總結(jié)一代致癌性小鼠模型經(jīng)驗(yàn)與不足的基礎(chǔ)上，充分考慮上述影響因素后而設(shè)計(jì)的。鑒于常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在局限，二代致癌性小鼠采用了全新的ES打靶大片段定點(diǎn)整合技術(shù)。
中檢院二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型， 是將3 個(gè)拷貝的人源c-Ha-ras 全長(zhǎng)基因組DNA 首尾串聯(lián)， 精準(zhǔn)插入C57BL/6J 小鼠15 號(hào)染色體E3位點(diǎn)（15E3） ，經(jīng)過(guò)多重篩選而得，其基因結(jié)構(gòu)圖如圖3 所示。插入的DNA 全長(zhǎng)片段約為21 kb，由于該原癌基因鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶所占的比率（GC）偏高，且含有重復(fù)序列，要實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合的操作難度很大，構(gòu)建需花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間。二代致癌性小鼠模型名稱中，“KI” 是“Knock-in” 的縮寫(xiě)，意指定點(diǎn)插入，與一代致癌性小鼠模型表示轉(zhuǎn)基因的“Tg”（transgenic）不同，轉(zhuǎn)基因一般為隨機(jī)插入，容易導(dǎo)致基因丟失，遺傳不穩(wěn)定；“C57” 表明其遺傳背景，即直接采用C57BL/6JES 進(jìn)行編輯，無(wú)需漫長(zhǎng)回交直接獲得純C57BL/6J 背景的模型；“ras”意指插入的基因?yàn)槿嗽丛┗騝-Ha-ras，不包含突變位點(diǎn)；二代致癌性小鼠模型具有明顯的優(yōu)勢(shì)，即遺傳穩(wěn)定、個(gè)體間均一，結(jié)果一致性更好。實(shí)際表型驗(yàn)證數(shù)據(jù)結(jié)果也表明，二代致癌性小鼠模型敏感、遺傳穩(wěn)定、表型優(yōu)良，為構(gòu)建我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的致癌性小鼠模型奠定了基礎(chǔ)。二代致癌性KI.C57-rasV2.0 小鼠模型較中檢院一代致癌性Tg.C57-ras V1.0 小鼠模型及Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠具有優(yōu)勢(shì)，這得益于其采用了先進(jìn)的ES 打靶技術(shù)，實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合。
測(cè)定二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型的22 項(xiàng)血液生理指標(biāo)和9 項(xiàng)血液生化指標(biāo)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性雌鼠、雄鼠和同窩陰性雌鼠、雄鼠相比各項(xiàng)指標(biāo)沒(méi)有差異，均在正常值范圍內(nèi)；9項(xiàng)血液生化指標(biāo)也無(wú)差異。這意味著二代致癌性小鼠模型血液生理生化指標(biāo)背景清晰干凈，有利于在藥物安全評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。
經(jīng)過(guò)給予MNU 致癌物驗(yàn)證，結(jié)果提示二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型能形成淋巴瘤、鱗狀細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞乳頭狀瘤、腺癌、腺瘤等腫瘤。值得注意的是，在特征性靶器官例如前胃和皮膚，能觀察到典型腫瘤類型，包括鱗狀細(xì)胞乳頭狀瘤和鱗狀細(xì)胞癌，且比例明顯高于野生型小鼠，組織病理學(xué)特征分析結(jié)果也與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道特征一致。另外，給予MNU 后，小鼠首次死亡時(shí)間、期末生存率及腫瘤發(fā)生率及關(guān)鍵特征靶器官與同窩陰性小鼠有明顯差異。通過(guò)對(duì)50 只小鼠為期6個(gè)月的自發(fā)性腫瘤觀察，發(fā)現(xiàn)僅1 只小鼠在6 個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)了脾淋巴瘤，表明自發(fā)性腫瘤發(fā)生率低，但目前尚缺少大規(guī)模觀察數(shù)據(jù)。
自二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型研發(fā)成功以來(lái)，得到業(yè)界廣泛關(guān)注。2020 年9 月，在北京召開(kāi)了人源化小鼠模型研究進(jìn)展研討會(huì)，會(huì)上專家、學(xué)者聽(tīng)取了致癌性模型的構(gòu)建過(guò)程及驗(yàn)證結(jié)果，并一致支持推動(dòng)這一具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)且彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)短板的模型動(dòng)物的國(guó)產(chǎn)化[60]。截至目前，中檢院已經(jīng)向我國(guó)10余家制藥企業(yè)提供了二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型， 用于新藥評(píng)價(jià)、致癌性試驗(yàn)平臺(tái)建設(shè)及食品添加劑、醫(yī)療器械、生物大分子的潛在致癌性試驗(yàn)。在獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局GLP 認(rèn)證的20 家機(jī)構(gòu)中，有7 家使用過(guò)二代致癌性KI.C57-ras V2.0小鼠模型。通過(guò)對(duì)已經(jīng)完成致癌性試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析表明，在給予MNU 后二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型的首次死亡時(shí)間，期中和期末生存率、腫瘤發(fā)生率（100%）、腫瘤譜（腫瘤類型）及關(guān)鍵特征靶器官比較一致，表明該模型不僅較同窩陰性小鼠具有更高的致癌敏感性，可重復(fù)性好，且與ILSI 的ACT研究項(xiàng)目中所涉及的日本致癌模型的 MNU 誘導(dǎo)后產(chǎn)生的致癌實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)相同或接近，但數(shù)據(jù)量有待進(jìn)一步充實(shí)。這些已有數(shù)據(jù)表明，二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型較一代質(zhì)量大幅度提升，對(duì)致癌物敏感，具備作為標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型用于藥物臨床前致癌性試驗(yàn)的潛力。
3.2.3 其他致癌模型
我國(guó)多家相關(guān)企業(yè)或機(jī)構(gòu)也研發(fā)了同類致癌性小鼠模型。據(jù)公開(kāi)資料顯示，北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司構(gòu)建的CB6F1-Tg（HRAS）9/Vst 小鼠（ 以下簡(jiǎn)稱rasH 小鼠）采用轉(zhuǎn)基因方法構(gòu)建[61]，轉(zhuǎn)入基因包含人原癌基因的編碼序列、內(nèi)含子以及上下游非編碼區(qū)的染色體DNA 片段。將DNA 片段注射到C57BL/6N小鼠受精卵的原核內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性首建鼠，分別擴(kuò)繁建系，進(jìn)行表型分析，從中篩選符合致癌性試驗(yàn)的第9 個(gè)系保留。用數(shù)字定量PCR 法確定該小鼠串聯(lián)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)4 個(gè)，用染色體步移法確定轉(zhuǎn)基因串聯(lián)片段，并整合于小鼠第6 號(hào)染色體上。利用免疫印跡法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示HRAS 在小鼠前胃和肺中具有較高的表達(dá)量。江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司采用了轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將人原癌基因Hras 進(jìn)行基因改造后，連同內(nèi)源性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子轉(zhuǎn)入B6 小鼠體內(nèi)，命名為B6J-Tg（hHRAS）16/Gpt轉(zhuǎn)基因小鼠，即Tg（hHras） [62]。本文根據(jù)公開(kāi)數(shù)據(jù)對(duì)上述幾種小鼠模型進(jìn)行了特征比較，見(jiàn)表5。
4、藥物致癌性試驗(yàn)替代方法的建立
4.1 藥物致癌性試驗(yàn)替代方法建立的必要性
目前，國(guó)內(nèi)外均廣泛采用并接納ICH S1B 致癌性試驗(yàn)設(shè)計(jì)框架，采用2 年期大鼠試驗(yàn)加上6個(gè)月遺傳修飾動(dòng)物試驗(yàn)的評(píng)價(jià)已經(jīng)成為支撐新藥申報(bào)的主流數(shù)據(jù)。致癌性小鼠試驗(yàn)因其實(shí)驗(yàn)周期短、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、受自發(fā)性腫瘤干擾小的突出優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到制藥行業(yè)的重視[63]。
自“ 十三五” 以來(lái)， 我國(guó)著眼從制藥大國(guó)向制藥強(qiáng)國(guó)邁進(jìn)。據(jù)《自然》（Nature） 雜志發(fā)表的評(píng)述文章[64]， 近年來(lái)，我國(guó)創(chuàng)新藥首次新藥臨床試驗(yàn)（investigational new drug，IND） 申請(qǐng)的數(shù)量急劇增加。2010~2020 年， 國(guó)家藥品監(jiān)管部門共收到了1636 件創(chuàng)新藥的首次IND 申請(qǐng)，86% 來(lái)自國(guó)內(nèi)的制藥企業(yè)。2023 年， 我國(guó)Ⅰ類新藥申請(qǐng)1310 件，同比增加近34%。其中，中藥60 件，同比增加33% ；創(chuàng)新化學(xué)藥品626件，同比增加35% ；創(chuàng)新生物制品624 件， 同比增加32%。不難看出，我國(guó)創(chuàng)新藥在迅速發(fā)展，而新藥的臨床前致癌性試驗(yàn)需求必然隨之提升。
然而，目前致癌性試驗(yàn)小鼠資源來(lái)源唯一，且該模型進(jìn)口成本逐年上漲，由于致癌性試驗(yàn)單次動(dòng)物用量大，購(gòu)買動(dòng)物的成本占比不容小覷。此外，供應(yīng)鏈問(wèn)題還會(huì)受到其他因素的影響，制約了我國(guó)制藥企業(yè)的發(fā)展。我國(guó)制藥企業(yè)十分期待質(zhì)優(yōu)價(jià)廉國(guó)產(chǎn)致癌性小鼠模型。
4.2 中檢院建立致癌性試驗(yàn)替代小鼠模型的歷程
2004 年開(kāi)始，中檢院開(kāi)始組建遺傳修飾動(dòng)物模型平臺(tái)，隨即開(kāi)啟自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的致癌性小鼠模型研究。如前所述，先后研發(fā)了一代致癌性Tg.C57-ras V1.0小鼠模型和二代致癌性KI.C57-ras V2.0 小鼠模型，分析了模型的生物學(xué)特性，建立了胚胎冷凍及精子冷凍資源保存方法和規(guī)模化生產(chǎn)及供應(yīng)技術(shù)，組織開(kāi)展了多批次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并發(fā)表了一系列成果論文，獲得了多項(xiàng)專利授權(quán)，還先后向相關(guān)企業(yè)提供大批模型動(dòng)物，為推動(dòng)我國(guó)致癌性試驗(yàn)替代方法的建立發(fā)揮了主力作用。
4.3 建立我國(guó)致癌性小鼠模型的幾點(diǎn)思考
質(zhì)量可靠、經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證且能穩(wěn)定批量供應(yīng)的致癌性小鼠模型是建立我國(guó)致癌性試驗(yàn)替代方法的關(guān)鍵技術(shù)。第一，致癌性小鼠須具備清晰的遺傳背景，從打靶載體設(shè)計(jì)到完成構(gòu)建，均需充分論證。第二，要對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行充分細(xì)致地分析，闡明轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)、整合位點(diǎn)、序列等特征。第三，需要充分驗(yàn)證致癌性小鼠模型的敏感性和準(zhǔn)確性，必要時(shí)可開(kāi)展多中心聯(lián)合驗(yàn)證，并建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[65-67]。第四，建立對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行胚胎和精子冷凍保存，以確保模型供應(yīng)的一致性。第五，需要建立穩(wěn)定的批量生產(chǎn)體系和質(zhì)控體系（圖4）。第六，需要關(guān)注致癌性小鼠模型的自發(fā)性腫瘤發(fā)生率、生理生化參數(shù)背景數(shù)據(jù)，以保障小鼠模型質(zhì)量。
4.4 我國(guó)自建致癌性小鼠模型與國(guó)際致癌性小鼠模型的關(guān)系
國(guó)際上Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建大體上經(jīng)歷了模型構(gòu)建與生物學(xué)特性研究、多實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合驗(yàn)證、專家討論認(rèn)可3 個(gè)階段。聯(lián)合驗(yàn)證是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，旨在證明轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠較同窩野生型小鼠易感，證明小鼠模型的準(zhǔn)確性與靈敏度。我國(guó)自建致癌性小鼠圖4 中檢院致癌性小鼠模型的資源保存、生產(chǎn)和供應(yīng)體系模型同樣離不開(kāi)上述環(huán)節(jié)，但由于目前研究人員已積累了大量背景數(shù)據(jù)，充分認(rèn)可基于遺傳修飾動(dòng)物模型開(kāi)展致癌性試驗(yàn)結(jié)果，故無(wú)需像Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型，開(kāi)展幾十種致癌物的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。只需在遺傳基礎(chǔ)清晰前提下，開(kāi)展充足數(shù)量的驗(yàn)證，證明自建模型的可靠性即可。但需要考慮，我國(guó)自建的致癌性小鼠模型的表型需要與Tg.rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠比較，因?yàn)槟[瘤發(fā)生本身是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受模型動(dòng)物的影響，同樣受致癌性試驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的影響。
綜上，從支持我國(guó)新藥研發(fā)角度出發(fā)，建立具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的致癌性小鼠模型是必要而緊迫的。建立模型，需充分研究其生物學(xué)特性，建立資源保存和生產(chǎn)體系，開(kāi)展聯(lián)合驗(yàn)證，獲得必要的背景數(shù)據(jù)，以推動(dòng)業(yè)界及監(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)可，是建立致癌性小鼠模型的必然途徑。雖然建立我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的致癌性小鼠模型尚有待大量工作需要完成，但我國(guó)定會(huì)突破重重困難，實(shí)現(xiàn)致癌性小鼠模型的國(guó)產(chǎn)化。
來(lái)源：中國(guó)食品藥品監(jiān)管雜志
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