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前言

 

ICH《BIOANALYTICAL METHOD VALIDATION AND STUDY SAMPLE ANALYSIS》M10（以下簡稱“ICH M10”）自2022年5月24日頒布至今，已有兩年時間。本期，我們根據(jù)ICH M10、NMPA 2020版《中國藥典》9012部分指導(dǎo)原則（以下簡稱“NMPA 2020版”）以及FDA Bioanalytical Method Validation（以下簡稱“FDA BMV 2018版”）三者對于生物分析方法驗證以及樣品分析的相關(guān)具體要求，結(jié)合兩年中ICH M10的實施經(jīng)驗，對于色譜法生物分析方法驗證及樣品分析的實施細(xì)則進(jìn)行進(jìn)一步解析，以更加深入了解指導(dǎo)原則中的內(nèi)容。

 

1、方法的選擇性和特異性

 

ICH M10中對方法的“選擇性”和“特異性”進(jìn)行了明確區(qū)分，定義如下：

 

選擇性：

 

Selectivityis theability ofan analytical method to differentiateand measurethe analytein the presence of potential interfering substances in the blank biological matrix.

 

選擇性是分析方法在空白生物基質(zhì)中存在潛在干擾物質(zhì)的情況下區(qū)分和測定待測物的能力。

 

特異性：

 

Specificity is the ability of a bioanalytical method to detect and differentiate the analyte from other substances, including its related substances (e.g., substances that are structurally similar to the analyte, metabolites, isomers, impurities, degradation products formed during sample preparation, or concomitant medications that are expected to be used in the treatment of patients with the intended indication).

 

特異性是生物分析方法檢測和區(qū)分待測物與其他物質(zhì)的能力，包括相關(guān)物質(zhì)（例如與待測物結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)、代謝物、異構(gòu)體、雜質(zhì)、樣品制備過程中形成的降解產(chǎn)物，或預(yù)期目標(biāo)適應(yīng)癥患者的合并用藥）。

 

FDA 2018版BMV和中國藥典2020版中對于選擇性和特異性的描述通常放在同一章節(jié)，未作明顯區(qū)分。因此，按照ICH M10規(guī)則匯報時，需要將對應(yīng)的實驗結(jié)果按照“選擇性”和“特異性”分開匯報。

 

2、分析批容量

 

ICH M10中關(guān)于“分析批容量”考察的規(guī)定如下：

 

To enable the evaluation of any trends over time within one run, it is recommended to demonstrate accuracy and precisionof the QCs over at least one of the runs in a size equivalent to a prospective analytical run of study samples.

 

為了能夠評估一個分析批內(nèi)隨時間變化的任何趨勢，建議至少在一個分析批中證明質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和精密度，該分析批的大小應(yīng)與研究樣品預(yù)期分析批大小相當(dāng)。

 

中國藥典2020版中規(guī)定：

 

為評價一個分析批中不同時間的任何趨勢，推薦以質(zhì)控樣品分析批來證明準(zhǔn)確度，其樣品數(shù)不少于一個分析批預(yù)期的樣品數(shù)。

 

從上述兩個法規(guī)的規(guī)定中可以看出，ICH M10除了要求考察質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度，還需考察精密度。因此分析批容量需在一個準(zhǔn)確度和精密度批次中考察才能滿足此要求。

 

3、批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度

 

ICH M10中關(guān)于“批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度”考察的規(guī)定如下：

 

Within-run accuracy and precision should be evaluated by analysing at least 5 replicates at each QC concentration level in each analytical run.

 

批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)通過在每一分析批、對每個濃度水平的質(zhì)控樣品進(jìn)行至少5個樣品分析來評估。

 

中國藥典2020版中規(guī)定：

 

對于驗證批次精密度，至少需要一個分析批的4個濃度，即定量下限以及低、中、高濃度，每個濃度至少5個樣品。

 

FDA 2018版BMV中也強(qiáng)調(diào)了每個濃度考察5個重復(fù)：

 

A & P should be established with at least three independent A& P runs, four QC levels per run (LLOQ, L, M, H QC), and ≥ five replicates per QC level.

 

按照以往對于5 replicates（5個重復(fù)）的理解，考察時提取5個重復(fù)的質(zhì)控樣品并滿足準(zhǔn)確度和精密度的要求即可，對最終參與計算的測定值個數(shù)未作明確要求。此次結(jié)合ICH M10中的規(guī)定“by analysing at least 5 replicates”，對于每個濃度的質(zhì)控樣品，其最終參與計算的測定值建議應(yīng)不少于5個。舉例：如每個濃度考察6個重復(fù)的質(zhì)控樣品，則因為分析原因?qū)е聼o法準(zhǔn)確獲得最終測定值的質(zhì)控樣品每個濃度不能多于1個，否則無法滿足至少5個測定值參與最終計算的要求。

 

4、稀釋可靠性

 

ICH M10中關(guān)于“稀釋可靠性”的規(guī)定如下：

 

Dilution QCs should be prepared with analyte concentrations in matrix that are greater than the ULOQ and then diluted with blank matrix. At least 5 replicates per dilution factor should be tested in one run to determine if concentrations are accurately and precisely measured within the calibration range. The dilution factor(s) and concentrations applied during study sample analysis should be within the range of the dilution factors and concentrations evaluated during validation. The mean accuracy of the dilution QCs should be within ±15% of the nominal concentration and the precision (%CV) should not exceed 15%.

 

稀釋質(zhì)控樣品的濃度應(yīng)大于ULOQ，采用空白基質(zhì)對樣品進(jìn)行稀釋，每個稀釋因子至少5個測定值，并在同一批次進(jìn)行檢測，以確保檢測濃度在校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)被準(zhǔn)確、精密地測量。研究樣品分析過程中所用稀釋因子和濃度應(yīng)該處于方法學(xué)驗證的稀釋因子和濃度范圍內(nèi)。稀釋質(zhì)控的平均準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±15%之內(nèi)，精密度（%CV）不應(yīng)超過15%。

 

中國藥典2020版中規(guī)定：

 

樣品稀釋不應(yīng)影響準(zhǔn)確度和精密度。應(yīng)該通過向基質(zhì)中加入分析物至高于定量上限，并用空白基質(zhì)稀釋該樣品（每個稀釋因子至少5個測定值），來證明稀釋的可靠性。準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)在±15%之內(nèi)，稀釋的可靠性應(yīng)該覆蓋試驗樣品所用的稀釋倍數(shù)。

 

FDA 2018版BMV中規(guī)定：

 

QCs for planned dilutions, 5 replicates per dilution factor.

 

按照以往對于5 replicates（5個重復(fù)）的理解，考察時提取5個重復(fù)的稀釋質(zhì)控樣品并滿足準(zhǔn)確度和精密度的要求即可，對最終參與計算的測定值個數(shù)未作明確要求。此次結(jié)合ICH M10和中國藥典2020版，對于最終參與計算的稀釋質(zhì)控樣品的測定值建議應(yīng)不少于5個。舉例：如每個稀釋因子考察6個重復(fù)的稀釋質(zhì)控樣品，則因為分析原因?qū)е聼o法準(zhǔn)確獲得最終測定值的稀釋質(zhì)控樣品不能多于1個，否則無法滿足至少5個測定值參與最終計算的要求。

 

5、穩(wěn)定性

 

ICH M10中關(guān)于穩(wěn)定性的規(guī)定如下：

 

1、Stability of the analyte in the matrix is evaluated using low and high concentration QCs. Aliquots of the low and high QCs are analysed at time zero and after the applied storage conditions that are to be evaluated.

 

采用低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品考察基質(zhì)中待測物的穩(wěn)定性。低濃度和高濃度穩(wěn)定性質(zhì)控樣品應(yīng)分別在零時和考察條件下放置后進(jìn)行評價。

 

此處強(qiáng)調(diào)了穩(wěn)定性質(zhì)控樣品需在零時刻進(jìn)行評價，該要求在中國藥典2020版和FDA 2018版BMV中未明確規(guī)定。因此，在穩(wěn)定性樣品配制和分裝的過程中需注意考察零時刻的結(jié)果。

 

2、If the concentrations of the study samples are consistently higher than the ULOQ of the calibration range, the concentration of the high QC should be adjusted to reflect these higher concentrations.

 

如果研究樣品的濃度持續(xù)高于校準(zhǔn)曲線的ULOQ，則應(yīng)調(diào)高穩(wěn)定性質(zhì)控樣品的濃度，以反映這些較高濃度樣品的穩(wěn)定性結(jié)果。

 

此處強(qiáng)調(diào)了穩(wěn)定性質(zhì)控樣品需要涵蓋“持續(xù)高于ULOQ的研究樣品濃度”，該要求在中國藥典2020版和FDA 2018版BMV中未明確規(guī)定。因此，建議方法驗證中除了考察低和高質(zhì)控樣品的穩(wěn)定性外，酌情考慮增加稀釋質(zhì)控樣品的穩(wěn)定性用于覆蓋超出ULOQ部分的研究樣品濃度。

 

6、重新進(jìn)樣重現(xiàn)性

 

ICH M10中關(guān)于“重新進(jìn)樣重現(xiàn)性”的規(guī)定如下：

 

Reinjection reproducibility is assessed by reinjecting a run that is comprised of calibration standards and a minimum of 5 replicates of the low, middle and high QCs after storage. The precision and accuracy of the reinjected QCs establish the viability of the processed samples.

 

重新進(jìn)樣的重現(xiàn)性通過由儲存后的校正標(biāo)樣和至少5個低濃度、中濃度和高濃度QC組成的分析批重新進(jìn)樣來評估，以重新進(jìn)樣的QC樣品的精密度和準(zhǔn)確度確定處理后樣品重新進(jìn)樣的可行性。

 

ICH M10中對于重新進(jìn)樣重現(xiàn)性的考察單獨進(jìn)行了描述，而在NMPA 2020版和FDA 2018版BMV中無明確規(guī)定。同時，和其他穩(wěn)定性考察的低和高兩個濃度的質(zhì)控樣品要求不同，重新進(jìn)樣重現(xiàn)性則強(qiáng)調(diào)需要考察低、中、高三個濃度，在實際考察時此處需引起注意。

 

7、研究樣品重分析

 

ICH M10中關(guān)于“研究樣品重分析”的規(guī)定如下：

 

Possible reasons for reanalysis of study samples, the number of replicates and the decision criteria to select the value to be reported should be predefined in the protocol, study plan or SOP, before the actual start of the analysis of the study samples. For study samples in which multiple analytes are being analysed, a valid result for one analyte should not be rejected if the other analyte fails the acceptance criteria.

 

The number of samples (and percentage of total number of samples) that have been reanalysed should be reported and discussed in the Bioanalytical Report.

 

研究樣品分析開始前，應(yīng)該在方案、研究計劃或SOP中預(yù)先規(guī)定重新分析研究樣品的理由、重復(fù)次數(shù)以及報告值的選擇標(biāo)準(zhǔn)。對于正在分析多種待測物的研究樣品，如果其中一種待測物不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，不應(yīng)拒絕另一種待測物的有效結(jié)果。

 

應(yīng)在生物樣品分析報告中提供并討論重分析樣品的數(shù)量（以及占樣品總數(shù)的百分比）。

 

ICH M10要求匯報“重分析樣品的數(shù)量以及占樣品總數(shù)的百分比”，但在中國藥典2020版和FDA 2018版BMV中無此要求。因此，匯報時需注意提供該部分信息。

 

結(jié)語

 

綜上所述，我們對于ICH M10中容易被忽略或者同以往執(zhí)行規(guī)則有細(xì)微差異的相關(guān)規(guī)定結(jié)合兩年多的實施經(jīng)驗做了詳細(xì)解讀并提供了建議的解決方案。ICH M10作為統(tǒng)一的行業(yè)指導(dǎo)原則，對于相關(guān)考察項的執(zhí)行和匯報有更具體和詳細(xì)的要求，生物分析檢測實施過程中對相關(guān)細(xì)節(jié)把控需結(jié)合實際進(jìn)行解讀后執(zhí)行。