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問(wèn)：我新建了一種液相分離方法，但該方法似乎對(duì) pH 值的變化非常敏感。這是一個(gè)簡(jiǎn)單的反相色譜方法，我沒(méi)有使用任何的離子對(duì)試劑。我發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間每天都有很大的變化，我可以確認(rèn) pH 值確實(shí)存在微小變化。問(wèn)題出在哪里？

答：從您對(duì)問(wèn)題的描述來(lái)看，您所處理的是：pKa 值接近流動(dòng)相 pH 值的離子型化合物。因此，您需要處理兩種保留時(shí)間明顯不同的化合物。例如，這可能是質(zhì)子化和非質(zhì)子化形式的酸。帶電形式化合物的保留因子要比不帶電形式的要小得多。兩者之間的平衡取決于 pH 值。流動(dòng)相 pH 值的微小變化會(huì)改變化合物兩種形式的比例，從而影響保留時(shí)間。

因此，有必要嚴(yán)格控制 pH 值。由于您已經(jīng)做了一些實(shí)驗(yàn)，您可能已經(jīng)獲得了足夠的信息來(lái)定量了解保留時(shí)間與 pH 值的關(guān)系。如果還沒(méi)有，可以做一些對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得這方面的知識(shí)。此外，您還可以查看該方法的歷史記錄。這些信息應(yīng)該是在方法穩(wěn)健性測(cè)試過(guò)程中產(chǎn)生的。一旦有了依賴性，您就需要決定您可以接受的保留時(shí)間波動(dòng)范圍。然后計(jì)算 pH 值調(diào)整的精度。即使在困難的情況下，±0.02 pH 單位的精度也應(yīng)該足夠了。

問(wèn)：很難精確調(diào)節(jié) pH 值。如果只加一點(diǎn)點(diǎn)酸，pH 值就會(huì)發(fā)生很大變化。

答：不幸的是，這表明您使用的不是緩沖液。緩沖液的定義是：它可以緩沖少量酸或堿的 pH 值，也就是說(shuō)，加入酸或堿后，pH 值的變化應(yīng)該很小。這種維持 pH 值的能力稱為緩沖能力。它取決于緩沖液的濃度和緩沖離子的 pKa。在緩沖離子的 pKa 值時(shí)，緩沖能力最大。表 1 給出了 HPLC 中常用的一些緩沖液的 pKa。請(qǐng)注意，它們是在水中測(cè)量的，沒(méi)有添加有機(jī)溶劑。加入有機(jī)溶劑后，pKa 值會(huì)發(fā)生變化。但一般來(lái)說(shuō)，包括您的分析物在內(nèi)的所有化合物的 pKa 都會(huì)發(fā)生相同的偏移。

對(duì)于 HPLC 中常用的緩沖液濃度，緩沖液的 pH 值應(yīng)保持在緩沖離子 pKa 值附近 ±1.5 個(gè) pH 單位的范圍內(nèi)。對(duì)于 5 mM（毫摩爾）以下的極稀釋緩沖液，您可能需要將范圍進(jìn)一步縮小到 pKa 附近的 ±1 個(gè) pH 單位。

如表 1 所示，磷酸的 pKa 值約為 2 和 7。其中 4.5 處于中間位置，磷酸在此 pH 值下沒(méi)有任何緩沖能力。要緩沖 4.5 的 pH 值，您需要使用不同的緩沖劑，例如乙酸。

同樣，pH 值為 7 的乙酸銨溶液也不是緩沖液，而是鹽溶液。乙酸銨“緩沖劑”的使用已變得很流行，因?yàn)橐宜徜@易揮發(fā)，可與質(zhì)譜檢測(cè)器一起使用。但在 pH 值為 7 時(shí)，乙酸銨并不是緩沖劑，除非出于其他原因需要使用鹽，否則流動(dòng)相中最好不要使用乙酸銨。

表 1.常用緩沖液的 pKa 值（25°C 時(shí)）

問(wèn)：如何改進(jìn)方法？

答：如果使用的緩沖液 pH 值不合適，只需從表 1中選擇更合適的緩沖液即可。通常情況下，更換緩沖液不會(huì)影響分離效果，否則您可能需要進(jìn)行額外的調(diào)整。

有時(shí)，由于檢測(cè)器的限制，無(wú)法更換緩沖液。我們已經(jīng)提到過(guò)質(zhì)譜儀需要使用揮發(fā)性緩沖液。基于羧酸的緩沖液不太適合低紫外檢測(cè)，因?yàn)楸镜孜蛰^高，會(huì)導(dǎo)致噪音過(guò)大。如果找不到與檢測(cè)兼容的緩沖液，那就麻煩了。您要么可以接受現(xiàn)有的保留變異性，要么就應(yīng)該在所使用緩沖液的 pKa 值或接近 pKa 值的條件下重新制定方法。這顯然會(huì)大幅改變色譜圖，您需要從頭開(kāi)始重新優(yōu)化方法。這可能不是一個(gè)好消息，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，您會(huì)得到更好的結(jié)果。

我通常建議在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中首先選擇緩沖液，從而確定一般的 pH 值范圍，然后利用溶劑選擇性對(duì)分離進(jìn)行微調(diào)。這種方法開(kāi)發(fā)策略既快速又高效。它還能避免在緩沖液 pH 值方面出現(xiàn)錯(cuò)誤。在下一次方法開(kāi)發(fā)中，您不妨考慮一下這種方法。