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抗體聚集可導(dǎo)致亞可見(jiàn)顆粒的形成，并可能暴露通常未暴露的表位，導(dǎo)致免疫原性增加。適當(dāng)?shù)墓に囋O(shè)計(jì)和控制可以帶來(lái)一致和可接受的產(chǎn)品質(zhì)量。

蛋白質(zhì)溶液被泵送、攪拌和過(guò)濾，并暴露于各種材料中（不銹鋼、玻璃和塑料等），所有這些因素都可能導(dǎo)致聚集體形成?？贵w產(chǎn)品中雜質(zhì)被去除后并添加了緩沖液，產(chǎn)品將被填充到袋子、瓶子或不銹鋼罐中進(jìn)行后續(xù)儲(chǔ)存，直到最后填充到小瓶中。

圖1：一般單抗生產(chǎn)過(guò)程

產(chǎn)品灌裝是生產(chǎn)過(guò)程中的最后一步，灌裝后不再進(jìn)行凈化。在這一步驟中，如果不能完全防止聚集體的形成，則應(yīng)盡量減少。那么，哪些因素在最終罐裝時(shí)粒子產(chǎn)生中發(fā)揮影響以及采用什么手段來(lái)進(jìn)行合理規(guī)避呢？

灌裝過(guò)程會(huì)引入物理應(yīng)力（如剪切、摩擦和空化）來(lái)影響產(chǎn)品質(zhì)量，市面上有多種類型的灌裝泵，那么哪種泵在避免粒子產(chǎn)生中的性能較好呢？

研究表明，亞可見(jiàn)顆粒的形成在灌裝過(guò)程中隨著泵再循環(huán)次數(shù)的增加。其中，滾動(dòng)隔膜泵、蠕動(dòng)泵和時(shí)壓泵顆粒的形成慢，而活塞泵中不可見(jiàn)顆粒的增加較快。

圖2：泵/泵循環(huán)對(duì)不可見(jiàn)顆粒的影響

不銹鋼和陶瓷柱塞泵頭之間觀察到的顆粒數(shù)的差異較大，可能歸因于活塞-氣缸組件的設(shè)計(jì)：活塞/氣缸表面的機(jī)械光潔度（表面粗糙度）和結(jié)構(gòu)材料的差異。

陶瓷封頭柱塞泵的濁度趨勢(shì)最明顯，反映了可見(jiàn)顆粒的大幅增加。

圖3：泵循環(huán)對(duì)濁度的影響

在經(jīng)歷過(guò)20次循環(huán)后，在1-5μm范圍內(nèi)的顆粒約占總數(shù)的95%，1-10μm范圍內(nèi)的顆粒約占總數(shù)的99%，粒徑范圍大于10和25μm的顆粒分別約占0.5%和0.1%。

除了陶瓷柱塞泵外，1-2μm范圍約占所有情況的80%。陶瓷柱塞泵與其他泵產(chǎn)生的差異大，可能是由于陶瓷柱塞泵的比應(yīng)力不僅導(dǎo)致了總顆粒數(shù)量最多，而且更大顆粒的數(shù)量也更多。

圖4：20次循環(huán)后粒子分布

基于亞可見(jiàn)顆粒數(shù)據(jù)表明，活塞(陶瓷)>活塞(不銹鋼)>滾動(dòng)隔膜>time-pressure泵>蠕動(dòng)泵的粒子。

活塞泵的活塞旋轉(zhuǎn)和平移時(shí)，產(chǎn)品在活塞和氣缸之間的狹窄環(huán)形間隙中承受高剪切和摩擦，在沿著運(yùn)動(dòng)活塞和氣缸表面的局部壓降也有可能產(chǎn)生空化等可能造成了不可見(jiàn)顆粒升高。與活塞泵相反，在time-pressure填料中，加藥容器保持恒定的低壓（通常為0.5 bar）；壓力差用氣體補(bǔ)償（通常為氮?dú)猓?，通過(guò)打開(kāi)固定時(shí)間的閥門(mén)進(jìn)行加藥，整個(gè)過(guò)程通過(guò)可編程邏輯控制器或微處理器控制，這使得其優(yōu)于活塞泵。在蠕動(dòng)泵中，溶液在彈性管中向前流動(dòng)是由蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)驅(qū)動(dòng)的；滾動(dòng)隔膜泵的工作原理類似于旋轉(zhuǎn)柱塞泵，沒(méi)有旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，而且產(chǎn)品是由彈性隔膜與活塞分開(kāi)的。

使用蠕動(dòng)泵進(jìn)行灌裝通常比使用其他類型的泵觀察到的微粒水平更低，即蠕動(dòng)泵是在粒子考察中最優(yōu)選的輸送罐裝選擇。實(shí)際上，在抗體的下游加工過(guò)程中，泵的使用非常廣泛，不僅僅在最后產(chǎn)品的罐裝中，特別是在那些需要流量控制的步驟中頻率更高。

非蛋白顆粒是不是可能從所使用的泵管材中脫落，造成粒子產(chǎn)生？

在一份研究中采用了三種不同的管路（(1) Accusil Tubing from Watson-Marlow; (2) Masterflex L/S Tubing from Cole-Parmer;and (3) Pharmed BPT Tubing from Saint-Gobain.）進(jìn)行了蠕動(dòng)泵輸送實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在僅輸送PBS的情況下，以上3種管材均不會(huì)造成粒子產(chǎn)生。通過(guò)MasterFlex管泵送的IVIG（免疫球蛋白抗體）溶液產(chǎn)生的微粒水平最高，而通過(guò)Pharmed BPT管泵送的IVIG溶液產(chǎn)生的微粒水平要低得多。

圖5：顆粒濃度，流動(dòng)成像(a-c)、納米顆粒跟蹤分析(d-f)和共振質(zhì)量測(cè)量(g-i)三種檢測(cè)方式

但也有研究表明泵管老化后會(huì)增加粒子的產(chǎn)生（見(jiàn)下文），因此，生產(chǎn)中應(yīng)該根據(jù)產(chǎn)品種類來(lái)選擇合適的泵管類型。

一般而言，抗體在最終罐裝時(shí)會(huì)采用不同buffer而不是僅采用PBS。其中，甘氨酸是抗體輔料中常見(jiàn)的緩沖劑，將抗體buffer換為甘氨酸后進(jìn)行如上實(shí)驗(yàn)。

研究發(fā)現(xiàn)，不同的管道類型產(chǎn)生了不同的研究結(jié)果：使用Masterflex管，在PBS中泵送時(shí)形成的微粒水平遠(yuǎn)高于IVIG在pH 4.2甘氨酸緩沖液中泵送時(shí)形成的微粒水平；當(dāng)使用Pharmed BPT管進(jìn)行研究時(shí)，只有很小的差異，而在使用Accusil管進(jìn)行泵送時(shí)，微粒水平基本上沒(méi)有差異。

圖6：顆粒濃度（甘氨酸 vs PBS）

因此，輔料種類也是影響選擇泵管的因素。

而且，聚山梨酸酯80（PS80）的存在極大地抑制了IVIG溶液通過(guò)所有三種品牌管道蠕動(dòng)泵送過(guò)程中微粒和納米顆粒的形成。

圖7：顆粒濃度（PS80 vs PBS）

非離子表面活性劑可以抑制蛋白質(zhì)分子在管道內(nèi)壁的吸附，極大地減少了加工過(guò)程中的蛋白質(zhì)聚集。上述數(shù)據(jù)表明，合適輔料的添加會(huì)減少顆粒的產(chǎn)生。

在實(shí)際的操作中，泵的轉(zhuǎn)速是最基本的控制因素。研究表明：與泵送緩沖液相比，泵送蛋白質(zhì)溶液導(dǎo)致明顯更高的顆粒濃度，顆粒水平隨著轉(zhuǎn)速的增加而下降。

圖8：不同泵轉(zhuǎn)速對(duì)濁度和粒子的影響

泵轉(zhuǎn)速的增加可能減少了產(chǎn)品在極度應(yīng)力下的時(shí)間來(lái)減少粒子產(chǎn)生。因此在實(shí)際操作中應(yīng)注意：一方面在泵管表面與蛋白質(zhì)之間的短接觸時(shí)間之間取得平衡，另一方面保持泵管的完整性（泵管的疲勞會(huì)增加顆粒的產(chǎn)生）。

圖9：泵管拉伸過(guò)程中形成的顆粒（含不可見(jiàn)的顆粒，蛋白可見(jiàn)）

滾輪與泵頭的間隙內(nèi)剪切最大，機(jī)械剪切類似于泵頭內(nèi)管的拉伸和壓縮，是三個(gè)主要作用的復(fù)雜疊加。

圖10：油管壁上剪應(yīng)力

塑料顆粒從管道表面脫落取決于材料的表面粗糙度和耐磨性，與蛋白質(zhì)顆粒相比，盡管其水平有些時(shí)候可以忽略不計(jì)，但顆粒的產(chǎn)生也需要避免。

對(duì)管材基礎(chǔ)材料的一般推薦是困難的，因?yàn)椴牧系奶匦匀Q于熔體成分，包括基礎(chǔ)成分、聚合物添加劑（如穩(wěn)定劑或加工劑）以及制造商定義的制造工藝。

至于操作溫度而言，在8°C或在25°C完全冷藏下操作則沒(méi)有區(qū)別。

圖11：在不同溫度對(duì)濁度和粒子的影響

生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)（細(xì)胞因子）與單克隆相比，蠕動(dòng)泵罐裝是否會(huì)產(chǎn)生粒子差異？數(shù)據(jù)顯示：與單克隆抗體制劑相比，細(xì)胞因子在泵送后均顯示出更高的顆粒數(shù)。

圖12：蠕動(dòng)泵送后mAb、HGH和IL-11各自散裝配方的比較

實(shí)際操作中，根據(jù)產(chǎn)品特異性來(lái)選擇生物制品的灌裝系統(tǒng)。即，生產(chǎn)過(guò)程中的最后一步的產(chǎn)品灌裝為了避免粒子產(chǎn)生，要考慮泵類型、工藝參數(shù)、產(chǎn)品類型等一系列參數(shù)。

參考材料：

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2.Nayak A. Characterization of subvisible particle formation during the filling pump operation of a monoclonal antibody solution. J Pharm Sci. 2011

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4.Deiringer N. Proteins on the Rack: Mechanistic Studies on Protein Particle Formation During Peristaltic Pumping. J Pharm Sci. 2022