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     調(diào)整流動(dòng)相的條件以適應(yīng)LCMS分析主要涉及以下幾個(gè)方面：

 

1. 選擇合適的流動(dòng)相組成

 

     常用的流動(dòng)相包括乙腈、甲醇、水以及它們不同比例的混合物，還可以加入易揮發(fā)的酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。應(yīng)避免使用非揮發(fā)性緩沖鹽，如磷酸鹽，因?yàn)樗鼈兛赡軐?dǎo)致LCMS接口堵塞。

 

     ①流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

 

     ②純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。

 

      ③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。

 

     ④粘度要低（應(yīng)<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長。最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。

 

     ⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。

 

      ⑥樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。

 

2. 優(yōu)化流動(dòng)相的pH值

 

     留意色譜柱說明書中的pH適用范圍，目前市面上大部分鍵合硅膠色譜柱表示的pH適用范圍是2-10，但在實(shí)際使用時(shí)應(yīng)避免極端的pH條件。pH值的調(diào)整要考慮到待測化合物的pKa值。一般來說，pH值應(yīng)至少高于pK值兩個(gè)單位，以便于化合物的離子化。對于酸性樣品，如含有谷氨酸和天冬氨酸的肽類，可以用氨水或三乙胺進(jìn)行堿化。

 

     對于可電離的化合物，要獲得最強(qiáng)的反相保留，分析物應(yīng)盡可能的不帶電或電離，此時(shí)分析物極性相對較小，在反相色譜柱上的保留就更強(qiáng)，中性化合物無任何可電離基團(tuán)，不受pH影響。

 

      酸性和堿性化合物在其未電離狀態(tài)下時(shí)反向保留最大，中性化合物的保留不受pH影響。

 

 

3. 選擇適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相添加劑

 

     為了提高離子化效率，可以在流動(dòng)相中加入一些添加劑，如甲酸銨、乙酸銨等。這些添加劑可以幫助調(diào)節(jié)pH值，并促進(jìn)化合物的離子化。

 

酸類

 

1、甲酸：通常使用的濃度在1%以下，能夠讓水的pH達(dá)到二點(diǎn)幾的級別。

 

2、乙酸：酸性比甲酸略弱，通常使用濃度不超過5%，能夠使水的pH到達(dá)到二點(diǎn)幾的級別。

 

3、三氟乙酸：比較強(qiáng)的酸，使用濃度通常不超過0.5%，能使水的pH達(dá)到2以下，具有很大的離子強(qiáng)度及一定的離子對作用，是分析蛋白/多肽時(shí)常用的添加劑。

 

以上三種酸最致命的問題在于低波長下的紫外吸收，通常不建議在小于215nm波長的情況下使用，另外就是甲酸/乙酸還有比較大的揮發(fā)性，時(shí)間久了濃度會發(fā)生變化。

 

4、磷酸：這是一種不揮發(fā)性的酸，離子強(qiáng)度也不錯(cuò)，最重要的是，它在低波長紫外區(qū)無本底吸收，但是它也存在不少缺點(diǎn)，比如不能兼容質(zhì)譜方法，對色譜柱壽命影響大等。

 

除此之外，還有一些其他的酸，比如硫酸，鹽酸或者檸檬酸，但是都是非常少的使用了。

 

堿類

 

     堿類添加劑常見的是氨水和三乙胺，兩者都能讓水的pH到達(dá)非常高的水平，高到能把硅膠顆粒溶解掉，要慎用，另外就是這兩種溶劑通常不太容易很干凈，尤其是三乙胺，即使是色譜純，放的久了也可能會由于變質(zhì)導(dǎo)致污染。

 

鹽類

 

     比起單純的酸堿，鹽類，特別是具有緩沖能力的鹽類可以很好的控制流動(dòng)相的pH值，根據(jù)不同緩沖鹽中兩種鹽的配比，可以很容易的配置出一定pH的緩沖溶液。

 

1、甲酸鹽

 

     通常在液相色譜中常用的甲酸鹽都是甲酸銨，這類鹽的溶解度好，完全兼容液質(zhì)聯(lián)用的方法，對色譜柱的傷害也比較小，但是缺點(diǎn)是離子強(qiáng)度比較低，另外就是甲酸鹽比較容易吸潮，稱量的時(shí)候比較困難，在流動(dòng)相里還可能揮發(fā)。

 

     與甲酸配合，可以得到甲酸-甲酸銨緩沖體系，大概緩沖能力在pH3～4.5的范圍之內(nèi)，只要調(diào)節(jié)兩者濃度的比例即可。

 

2、乙酸鹽

 

     常見為乙酸銨，在使用上，和甲酸鹽十分類似，離子強(qiáng)度也不高，與乙酸配合的乙酸-乙酸銨緩沖體系pH的控制能力在pH4～5.5左右。

 

3、磷酸鹽

 

     常用的是磷酸的鈉鹽和鉀鹽，二者對pH的控制能力十分接近，只是離子強(qiáng)度稍有差異，絕大多數(shù)情況下是可以互換使用的，磷酸由于是多元酸，能夠形成一氫鹽和二氫鹽，所以使用磷酸緩沖體系調(diào)節(jié)pH也是組合比較多，跨度比較大的，并且可以提供較高的離子強(qiáng)度，可惜，磷酸鹽流動(dòng)相體系無法兼容質(zhì)譜，并且對色譜柱損傷較大。

 

    以磷酸鈉鹽為例，可以有以下兩種組合的緩沖體系：

 

磷酸-磷酸二氫鈉：pH可以達(dá)到1.2～3.1左右的范圍；

 

磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉：pH可以達(dá)到6.5～8左右的范圍。

 

     上述的緩沖對能調(diào)節(jié)的pH范圍指的都是在保持緩沖能力的范圍之內(nèi)，如果僅僅是調(diào)節(jié)pH的話，范圍還可以再擴(kuò)展一些。

 

4. 確定合適的流速

 

     流速的選擇需要結(jié)合所用色譜柱的內(nèi)徑、柱分離效果以及流動(dòng)相的組成進(jìn)行考慮。較小的流速可以獲得較高的離子化效率，因此在條件允許的情況下，最好采用內(nèi)徑較小的色譜柱。

 

1）柱壓過高時(shí)，盡可能采用較小的流速，以不超過柱最大允許壓力的一半為宜。

 

2）當(dāng)流速較大時(shí)，應(yīng)采取流速梯度的辦法使流速分步到位。

 

3）使用手動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí)，進(jìn)樣閥的切換要盡可能的快。否則超過20%的壓力沖擊會很快使柱報(bào)廢。當(dāng)使用多柱聯(lián)用時(shí)，柱切換要避免在高壓下進(jìn)行。

 

5. 考慮色譜柱的溫度

 

     色譜柱的溫度會影響分離效果和離子化效率。通常，色譜柱的溫度可以設(shè)置在30℃至50℃之間，以獲得較好的分離效果。

 

    一般以硅膠為基質(zhì)的色譜柱最高使用溫度不超過60℃，以低于40℃為宜，特別是在流動(dòng)相pH接近使用限度時(shí)，更應(yīng)降低使用溫度。

 

     溫度過高會加快鍵合相的水解和硅膠的溶解，從而使填料性質(zhì)改變，柱床塌陷，降低柱效，改變峰形。

 

6. 流動(dòng)相優(yōu)化策略

 

原則1：由強(qiáng)到弱

 

     一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

 

原則2：三倍規(guī)則

 

    每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。

原則3：粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)

 

     當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

 

     溶劑強(qiáng)度順序：水＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氫呋喃＜丙酮＜二氯甲烷其中二氯甲烷和水不互溶，其余和水互溶。TIPS:根據(jù)實(shí)際情況，有時(shí)使用混合流動(dòng)相會有很好的效果。

 

7. 注意事項(xiàng)

 

     流動(dòng)相通常由水或緩沖溶液與有機(jī)溶劑混合而成。原則上，所有經(jīng)過色譜柱的流動(dòng)相均應(yīng)過濾，但在實(shí)際操作上應(yīng)視具體情況而有所區(qū)別：當(dāng)有機(jī)溶劑用色譜純級，水用石英亞沸水或其它超純水時(shí)，在能確保水和有機(jī)溶劑的質(zhì)量且沒有受到污染時(shí)，過濾并無更多實(shí)際意義。

 

     當(dāng)流動(dòng)相中含有緩沖鹽時(shí)，則過濾是必要的，如前所述，當(dāng)緩沖溶液放置一段時(shí)間，在使用前還應(yīng)重新過濾（含有緩沖鹽的流動(dòng)相，長菌較快，建議現(xiàn)用現(xiàn)配）。

 

     所配制的樣品試液在注入流路系統(tǒng)前均要經(jīng)0.45μm(0.22μm則更好)孔徑濾膜過濾。要注意區(qū)分水系和油系，二者不可混用，以防止濾膜溶解而造成污染。

 

    裝流動(dòng)相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線濾器要定期清洗和更換，以避免濾器因過載而起不到過濾作用。

 

     通過以上步驟，可以有效地調(diào)整流動(dòng)相的條件，使其適應(yīng)LCMS分析的需求。