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嘉峪檢測網(wǎng) 2024-07-25 09:36
有關(guān)物質(zhì)是藥品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，HPLC是有關(guān)物質(zhì)檢查的主要方法， HPLC測定雜質(zhì)含量最理想方法為雜質(zhì)外標(biāo)法，但雜質(zhì)對照品往往不易獲得，加校正因子的主成分自身對照法或主成分外標(biāo)法應(yīng)運而生，已成為各國藥典中HPLC測定雜質(zhì)含量的主要方法。
校正因子易受到多種因素影響，即使采用相同的分析方法，校正因子也可能因儀器、色譜柱、分離度等影響而存在差異，因此雖然法定方法收載了校正因子，亦需進(jìn)行校正因子的驗證或確認(rèn)。當(dāng)實測校正因子與藥典存在較大差異時，應(yīng)進(jìn)行分析解釋。
一、校正因子的定義
HPLC定量測定中的校正因子是某物質(zhì)與所選定的參照物質(zhì)的絕對校正因子之比，各國藥典表述略有不同。當(dāng)校正因子在0.2~5.0范圍以外時，應(yīng)改變檢測波長或參照物并重新確立校正因子，或采用雜質(zhì)外標(biāo)法進(jìn)行定量。
1相對響應(yīng)因子與校正因子互為倒數(shù)關(guān)系。2即按校正因子1.0計；USP-NF 2022起，在通則<621> Chromatography中刪除了當(dāng)相對響應(yīng)因子超出0.8~1.2范圍時使用校正因子的表述。
二、校正因子的確立方法
HPLC校正因子的確立方法主要包括單點法、多點法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線法是確定校正因子最常用的方法。
（1）單點法
制備適當(dāng)濃度的雜質(zhì)對照品溶液（cA）和主成分對照品溶液（cB），進(jìn)樣分析得到雜質(zhì)峰面積（AA）和主成分峰面積（AB），按下式計算待測雜質(zhì)的校正因子。
（2）多點法
制備至少涵蓋定量限至雜質(zhì)限度的多個濃度雜質(zhì)對照品溶液和主成分對照品溶液，進(jìn)樣分析，按照單點法公式計算得到多個校正因子，取平均值即得。
（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線法
制備至少涵蓋定量限至雜質(zhì)限度的系列濃度雜質(zhì)對照品溶液和主成分對照品溶液，進(jìn)樣分析分別得到雜質(zhì)和主成分標(biāo)準(zhǔn)曲線，主成分標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值即為校正因子。
三、實測結(jié)果與藥典不同的分析解釋
校正因子研究是CDE發(fā)補的重點內(nèi)容之一，近年來CDE尤為關(guān)注申報企業(yè)實測校正因子與藥典收載值的一致性，例如以下發(fā)補意見：本品采用USP收載的有關(guān)物質(zhì)分析方法，方法學(xué)驗證結(jié)果顯示雜質(zhì)A和雜質(zhì)F自測校正因子與USP差異大，請分析原因，并選擇合適的雜質(zhì)定量方法。
實測校正因子與藥典收載值差異大的可能原因主要包括以下幾點：
3.1 對照品賦值不準(zhǔn)確
雜質(zhì)對照品賦值準(zhǔn)確與否直接影響校正因子值，由于雜質(zhì)對照品純化過程通常無法完全除去有機溶劑、水分、無機鹽等雜質(zhì)，因此應(yīng)采用含量值（Assay）而非純度值（Purity）進(jìn)行校正因子計算。如對照品含量過低，應(yīng)評估其適用性。
雜質(zhì)對照品的定量方法主要包括質(zhì)量平衡法和定量核磁共振法。由于雜質(zhì)對照品不易獲得，一般可采用TGA等微量方法替代傳統(tǒng)的質(zhì)量平衡法，再結(jié)合HPLC色譜純度計算其含量。定量核磁共振法則利用1H-NMR譜中響應(yīng)的積分值與化合物的質(zhì)子當(dāng)量成反比且與濃度成正比的原理，通過在樣品中加入已知含量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，即可計算出所測定對照品的含量。1H-NMR法需要選擇合適的內(nèi)標(biāo)物和參與定量的質(zhì)子，以避開對照品中類似結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)影響賦值準(zhǔn)確性。
對照品賦值偏高將使得校正因子值偏大，反之則偏小。通常，優(yōu)選法定來源且賦值明確的雜質(zhì)對照品。需要注意的是，中檢院、EDQM及USP部分雜質(zhì)說明書中注明僅用于系統(tǒng)適用性或定位，應(yīng)評估其含量的準(zhǔn)確性。例如，某品種采用中檢院雜質(zhì)對照品進(jìn)行研究，結(jié)果顯示其校正因子為1.3，而USP收載值為1.1，CDE發(fā)補要求解釋差異。企業(yè)采用1H-NMR定量法測定中檢院對照品的含量為86.4%，而說明書中的含量值為98.9%，兩者存在明顯差異。按照核磁定量值計算，該雜質(zhì)的校正因子為1.1，與USP一致。
3.2 對照品發(fā)生降解
對照品降解是造成實測校正因子與藥典值不一致的重要原因。雜質(zhì)對照品或雜質(zhì)對照品所配制的對照品溶液發(fā)生降解，將使得校正因子偏大。主成分對照品或主成分對照品溶液發(fā)生降解，則將使校正因子偏小。
因此，對照品的保存應(yīng)嚴(yán)格按照其貯藏條件，并關(guān)注對照品在貯藏過程的穩(wěn)定性情況。部分對照品本身穩(wěn)定性極差，此類對照品關(guān)注COA報告中的賦值時間，盡量采購近期新標(biāo)定的對照品，并在采購后盡快完成研究。引濕性強的對照品吸潮后含量不再準(zhǔn)確，且可能進(jìn)一步降解，建議按小包裝規(guī)格采購，開封后盡快使用并妥善保存，在稱量過程應(yīng)嚴(yán)格控制環(huán)境濕度。
酯類、內(nèi)酯、酰胺等結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在含水體系中的穩(wěn)定性可能較差，應(yīng)考察對照品在有關(guān)物質(zhì)測定稀釋劑中的穩(wěn)定性情況，必要時更換適合的稀釋劑，確保在考察期間溶液穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。需要關(guān)注的是，不同濃度下的溶液其降解情況可能不一致，必要時應(yīng)加以驗證。
另一方面，由于雜質(zhì)對照品穩(wěn)定性問題或可及性問題，藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可能未進(jìn)行校正因子驗證，按默認(rèn)校正因子1.0計。例如某品種多個雜質(zhì)實測校正因子與USP差異較大，經(jīng)了解，該品種USP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)由印度某企業(yè)參與起草，經(jīng)聯(lián)系該企業(yè)，其反饋其中3個特定雜質(zhì)由于穩(wěn)定性問題未進(jìn)行驗證，1個雜質(zhì)由于未獲得對照品而未進(jìn)行驗證，均按照默認(rèn)值1.0定入USP。
3.3 雜質(zhì)在色譜體系下發(fā)生互變
含活潑羰基化合物在特定的HPLC體系及溶劑中可能以原型、水合半縮醛/酮、醇合半縮醛/酮等多種形態(tài)存在，也有學(xué)者認(rèn)為是酮式-烯醇式互變異構(gòu)，其動態(tài)平衡受稀釋劑種類、流動相pH值、柱溫、存放時間等多重因素影響[1]。這種互變可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)中生色團發(fā)生變化，使得不同形態(tài)化合物紫外響應(yīng)存在差異。例如，乙酰乙酸乙酯酮式結(jié)構(gòu)UV λmax為204nm和280nm且吸收系數(shù)ε很小，而烯醇式結(jié)構(gòu)λmax=245nm且ε很大，兩者呈現(xiàn)出完全不同的紫外吸收特征[2]。
此類化合物測定時可能產(chǎn)生多個色譜峰，且其在溶液和色譜體系中的存在形態(tài)將影響校正因子結(jié)果。例如頭孢吡肟EP雜質(zhì)C，其對照品溶液配制后峰面積迅速增大，而后趨于平衡，測得校正因子值與0h比較變化明顯。
圖 頭孢吡肟EP雜質(zhì)C原型與水合半縮醛互變
此類化合物校正因子測定結(jié)果的影響因素多，實測結(jié)果可能與藥典差異非常大，例如某品種雜質(zhì)實測值為1.5，而藥典標(biāo)準(zhǔn)為3.1，可通過結(jié)構(gòu)特征解釋此種差異，并優(yōu)選采用法定標(biāo)準(zhǔn)收載的校正因子值。
3.4 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)錯誤
藥典中收載的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)或企業(yè)獲得的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)結(jié)構(gòu)可能存在錯誤，導(dǎo)致校正因子測定值存在差異。筆者曾遇到某品種雜質(zhì)，其結(jié)構(gòu)收載于USP中，按照此結(jié)構(gòu)采購對照品后，實測RRT和校正因子均與USP相差甚遠(yuǎn)，后經(jīng)LC-MS、DAD光譜等研究發(fā)現(xiàn)，USP中收載的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)有誤，遂在該品種申報時修正了雜質(zhì)結(jié)構(gòu)、RRT及校正因子。
另一個案例是，雜質(zhì)對照品（供應(yīng)商A）定位結(jié)果、校正因子與法定標(biāo)準(zhǔn)存在明顯差異，于是從供應(yīng)商B處采購了該雜質(zhì)，結(jié)果顯示兩家供應(yīng)商雜質(zhì)RRT不同，且供應(yīng)商B提供的對照品測得的RRT、校正因子與藥典基本一致，后經(jīng)對1H-NMR譜進(jìn)行詳細(xì)分析，并結(jié)合2D-NMR，發(fā)現(xiàn)供應(yīng)商A提供的雜質(zhì)對照品基團連接位置有誤。
3.5 檢測波長不合適
通常HPLC檢測波長應(yīng)盡量避開吸收值急劇變化波段，但由于各雜質(zhì)的UV特征可能存在差異，有時無法兼顧所有雜質(zhì)。當(dāng)所選擇檢測波長在雜質(zhì)吸收值急劇變化波段，而主成分則在緩慢變化波段時，由于HPLC檢測器對于波長的準(zhǔn)確度要求一般為±2nm，不同儀器間的波長最大可相差4nm，可能會對測得校正因子產(chǎn)生較大的影響。
此種情況，建議對檢測波長附近的波長分別進(jìn)行校正因子研究，結(jié)合藥典收載值，基于嚴(yán)格控制雜質(zhì)策略選擇合適的校正因子，或改變檢測波長，必要時可采用雙波長法分別控制不同的雜質(zhì)。
也有文獻(xiàn)報道[3]，不同的檢測器可能影響校正因子值，佐匹克隆雜質(zhì)D采用DAD和VWD檢測器測定校正因子值分別為0.828和1.129，兩者相差超過30%。
3.6 色譜柱選擇不合適
色譜柱是HPLC分離的關(guān)鍵，可能影響保留時間和響應(yīng)、分離度等，部分化合物可能與色譜柱填料中殘留的硅醇基、金屬離子等發(fā)生相互作用，進(jìn)而影響校正因子測定結(jié)果。
有同行研究發(fā)現(xiàn)[4]，某雜質(zhì)采用三根不同色譜柱測得校正因子分別為4.1、2.3和1.6，法定值為1.3，推測化合物中的嘌呤結(jié)構(gòu)可能與色譜柱中的硅醇基發(fā)生吸附作用而導(dǎo)致。降低流動相pH值可使得實測校正因子的重復(fù)性良好且與法定值一致。當(dāng)然，也可選用封端色譜柱，并在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中注明。
因此，當(dāng)選用USP或EP標(biāo)準(zhǔn)，建議盡量選擇該品種官方推薦的色譜柱開展研究，具體色譜柱信息可在EDQM或USP官網(wǎng)獲得。
3.7 關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)收載雜質(zhì)及對照品是否含鹽基
應(yīng)關(guān)注藥典收載雜質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，明確雜質(zhì)是否含鹽基。例如，鹽酸丙米嗪EP雜質(zhì)A（去甲丙米嗪），ChP2020質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及中檢院對照品為鹽酸鹽，而EP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)則不含鹽基；瑞舒伐他汀鈣USP相關(guān)雜質(zhì)A和相關(guān)雜質(zhì)B對照品均為鈣鹽，而質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)則為酸形態(tài)。
因此，應(yīng)根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中雜質(zhì)和對照品的存在形態(tài)，在計算時予以考慮、折算，尤其是當(dāng)對照品為檸檬酸鹽、二乙胺鹽、四甲基銨鹽等分子量較大的鹽基形態(tài)時，可能嚴(yán)重影響校正因子測定結(jié)果。
3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定截距過大或濃度范圍不合適
單點法計算校正因子的前提是線性良好且假設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)過原點，標(biāo)準(zhǔn)曲線法使用斜率計算校正因子的前提是假設(shè)截距為0，因此線性截距大小將影響校正因子結(jié)果。目前常規(guī)做法未將截距校正為0，有文獻(xiàn)報道[5]，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)不低于0.999且斜率與截距的比值大于100時，截距可忽略不計。
因此，應(yīng)控制線性斜率在一定范圍內(nèi)。正的截距表示高濃度響應(yīng)的飽和度或相應(yīng)處有干擾存在，負(fù)的截距說明可能方法靈敏度存在問題或分析物質(zhì)殘留在容器或HPLC系統(tǒng)中[5]。同時，標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍亦影響校正因子結(jié)果，雜質(zhì)和主成分的濃度水平應(yīng)相當(dāng)，涵蓋定量限至限度以上，避免使用過高的濃度影響線性斜率。
四、總結(jié)
2012年CDE化藥共性問題解答中提到：考慮到校正因子測定的影響因素，如所用分析方法中相關(guān)條件均一致，可以直接采用ChP、USP、EP/BP或者其他權(quán)威公開標(biāo)準(zhǔn)中的相應(yīng)雜質(zhì)的校正因子；如相關(guān)條件發(fā)生變化，則需要重新測定。
由于校正因子影響因素多，同一品種采用相同方法不同，不同藥典收載的校正因子可能也不同，例如頭孢吡肟雜質(zhì)E，USP和EP校正因子分別為2.1和1.8，因此一般應(yīng)進(jìn)行校正因子驗證，并重點關(guān)注校正因子的重復(fù)性和耐用性。當(dāng)校正因子與藥典差異較大時，可從對照品、分析方法、操作過程、藥典的準(zhǔn)確性等方面進(jìn)行分析，如實測結(jié)果確實與藥典差異較大，因在申報資料中予以說明。
參考文獻(xiàn)：
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[2] 沈建紅, 秦向東, 裴靜, 等. 現(xiàn)代儀器, 2002, 6: 14-15.
[3] 洪淑華, 林琪珊, 柴將紅, 等. 中國藥物評價, 2023, 40(5): 384-389.
[4] 公眾號：小花曬太陽. 校正因子的實測值與法定值不一致.
[5] 肖亭, 王晨, 姚尚辰, 等. 藥學(xué)學(xué)報, 2020, 55(12): 2854-2861.
來源：注冊圈
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