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線性與范圍驗證是方法驗證中的重要組成部分，線性與范圍的選擇雖然在ICHQ2(R2):VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES、中國藥典2020年版9101《分析方法驗證指導原則》、《藥品GMP指南：質(zhì)量控制實驗室與物料系統(tǒng)》等指導原則中有解釋和舉例說明，但是在實際運用的過程中，不同人員仍然對線性與范圍濃度點的選擇有不同的理解，比如“自身對照法中，主成分線性與范圍驗證是否應該覆蓋最大雜質(zhì)濃度”等問題，本文結(jié)合對相關(guān)法規(guī)的理解和注冊檢驗、補充研究等經(jīng)驗，提出方法驗證中線性與范圍選擇時需注意的問題，有不妥之處，希望和大家一起探討。

對于雜質(zhì)檢查，ICHQ2(R2)中列表指出分析方法常見用途的可報告范圍為“報告閾值至規(guī)定產(chǎn)品標準限度的120%”、“為建立線性，建議在范圍內(nèi)適當分布至少5種濃度”[1]?！斗治龇椒炞C指導原則》中指出“應在設計的范圍內(nèi)測定線性關(guān)系?？捎猛粚φ掌焚A備液經(jīng)精密稀釋,或分別精密稱取對照品,制備一系列對照品溶液的方法進行測定，至少制備5個不同濃度水平”[2]。藥品GMP指南中指出“雜質(zhì)的定量測定：范圍應根據(jù)初步測定數(shù)據(jù),擬訂為規(guī)定限度的±20%”[3]。上述規(guī)定如何理解和實施呢，我們以一個例子來進行論證。

舉例：某供試品濃度為1mg/ml，對照溶液為1µg/ml，限度為“供試品溶液中如有雜質(zhì)峰，雜質(zhì)A峰面積不得過對照溶液的主峰面積（0.1%）；雜質(zhì)B峰面積不得過對照溶液的主峰面積的2倍（0.2%）；雜質(zhì)C峰面積不得過對照溶液的主峰面積的20倍（2.0%）；其他單個雜質(zhì)不得大于對照溶液的主峰面積的2倍（0.2%）；各雜質(zhì)校正后峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的30倍（3.0%）。（假設各雜質(zhì)定量限/報告限均為0.05%）”關(guān)于驗證時的線性范圍常見以下幾種選擇：

A：雜質(zhì)A、雜質(zhì)B與雜質(zhì)C均為0.5µg/ml~24µg/ml。

B：雜質(zhì)A：0.5µg/ml~1.2µg/ml、雜質(zhì)B：0.5µg/ml~2.4µg/ml、雜質(zhì)C：0.5µg/ml~24µg/ml。

C：主成分：0.5µg/ml~24µg/ml

D：主成分：0.5µg/ml~2.4µg/ml

E：主成分：0.5µg/ml~1.2µg/ml

本案例僅用于線性與范圍討論使用，不用于論證其他問題。

關(guān)于主成分和雜質(zhì)ABC的線性范圍：有些人選擇AC，主成分和各雜質(zhì)使用一個濃度范圍，涵蓋報告限度至最大雜質(zhì)限度濃度的120%，這樣操作方便快捷，配制一份貯備液，逐級稀釋，即可得到各線性濃度點。有些人選擇BE，因為ICHQ2(R2)中明確規(guī)定報告范圍為“報告閾值至規(guī)定產(chǎn)品標準限度的120%”，所以雜質(zhì)ABC的線性濃度點不同，應該使用各自限度的120%，而不是統(tǒng)一使用最大雜質(zhì)濃度的120%；主成分只需要驗證至對照溶液濃度的120%?？赡苡行┤肆晳T于其他選擇。

首先我們探討選項A與選項B，也就是關(guān)于雜質(zhì)A、B、C的線性范圍，ICHQ2(R2)中規(guī)定報告范圍為“報告閾值至規(guī)定產(chǎn)品標準限度的120%”，例如我們進行殘留溶劑方法驗證時，甲醇限度0.3%，乙醇限度0.5%，通常做的范圍為：甲醇LOQ~0.45%，乙醇LOQ~0.75%，而不是甲醇和乙醇都是LOQ~0.75%，而關(guān)于雜質(zhì)也是同樣的道理，應該做的驗證范圍為“報告閾值至規(guī)定產(chǎn)品標準限度的120%”。

對于主成分的濃度范圍選擇，首先我們應該排除選項E：0.5µg/ml~1.2µg/ml，因為標準中其他單雜限度為0.2%，我們應該使用主成分代替未知雜質(zhì)進行其線性與范圍驗證，證明其在0.2%限度檢測時的準確性，所以線性與范圍應該包括2µg/ml。那么剩余的兩項，我們是選擇C：0.5µg/ml~24µg/ml還是D：0.5µg/ml~2.4µg/ml呢？

我們知道，液相色譜儀紫外檢測器遵循循朗伯-比爾定律，適用于檢測低濃度物質(zhì)，在濃度高時，會發(fā)生偏移。Pedro Lopez Garcia 在Analytical Method Validation一文中指出，以濃度的對數(shù)為橫坐標，以峰面積/濃度為橫坐標，在濃度較高時，數(shù)據(jù)會產(chǎn)生負偏差，典型圖譜見圖1，而這樣的偏差在線性相關(guān)系數(shù)等評價數(shù)據(jù)中難以被發(fā)現(xiàn)。

圖1 高濃度產(chǎn)生的數(shù)據(jù)偏差

我們將上述案例中的主成分進行線性試驗，數(shù)據(jù)覆蓋供試品濃度的0.05%~120%，具體數(shù)據(jù)見表1，以濃度的對數(shù)為橫坐標，以峰面積/濃度為橫坐標，圖譜見圖2，其數(shù)據(jù)如果使用序號1~5數(shù)據(jù)進行線性數(shù)據(jù)統(tǒng)計，范圍為0.5µg/ml~2.4µg/ml（接近選項D），相關(guān)系數(shù)r為0.9999，線性線性方程為y = 0.3929x + 0.0189；如果使用序號1~8數(shù)據(jù)進行線性數(shù)據(jù)統(tǒng)計，范圍為0.5µg/ml~25µg/ml（接近選項C），相關(guān)系數(shù)r為1.0000，線性線性方程為y = 0.3766x + 0.0489，2組數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)均符合要求，但是線性方程斜率有約4%的偏差；而我們實際使用建立的標準對樣品進行檢測時，使用自身對照法，限度制訂為“不得過對照溶液的**倍”，基準是對照溶液，只進一個自身對照溶液，也就是使用單點法統(tǒng)計數(shù)據(jù)并進行計算，其實質(zhì)是和零點兩點成一直線，也就是只使用序號3數(shù)據(jù)，其線性斜率為0.415，所以使用選項C的范圍進行線性與范圍驗證，更僅僅實際應用，也更接近實際結(jié)果。

表1線性試驗結(jié)果

圖2 數(shù)據(jù)處理圖

綜上，在進行方法驗證，尤其是進行自身對照法的方法驗證時，各雜質(zhì)的范圍應為“報告閾值至規(guī)定產(chǎn)品標準限度的120%”，自身對照溶液濃度建議使用其他單個雜質(zhì)的限度濃度，主成分的驗證范圍推薦使用其LOQ~自身對照溶液濃度的120%，而沒有必要做到最大單個雜質(zhì)限度的120%。這樣操作，你驗證的方法才是你所使用的方法。

參考文獻

[1] ICHQ2(R2):VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES.

[2]中國藥典2020年版9101《分析方法驗證指導原則》

[3]藥品GMP指南：質(zhì)量控制實驗室與物料系統(tǒng)

[4] Pedro Lopez Garcia，Ernesto Buffoni,et al. Analytical Method Validation[J].Wide Spectra of Quality Control，2011.