中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

摘  要

 

在采用高效液相色譜進(jìn)行分析方法開發(fā)時(shí)，色譜柱的選擇至關(guān)重要，色譜柱的鍵合基質(zhì)及鍵合相等對(duì)于化合物的分離非常重要，本文對(duì)其相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行簡(jiǎn)述，以期為方法開發(fā)色譜柱的選擇提供思路。

 

一、背景介紹

 

硅膠填料的生產(chǎn)、制作過程用于謙的《石頭吟》“千錘萬鑿出深山，烈火焚燒若等閑”來形容，恰如其分。從最初的硅酸巖原材料處理成水玻璃，進(jìn)而通過特殊工藝制成多孔硅膠微粒，最后在硅膠表面進(jìn)行化學(xué)修飾，鍵合特定的基團(tuán)，用于化合物的分離。每一道工藝的優(yōu)化都凝聚了色譜柱相關(guān)人員不懈的努力。從80年代的硅膠和有機(jī)聚合物的優(yōu)勢(shì)結(jié)合到21世紀(jì)的 “雜化顆粒技術(shù)”彌補(bǔ)了硅膠自身的缺陷（如硅醇基殘留以及Si-O鍵在堿性條件下（pH>8）斷裂的問題），使之應(yīng)用更為廣泛。

 

近年來，色譜柱研究人員又開發(fā)了鍵合相迵異的色譜填料以增強(qiáng)色譜柱的選擇性，如針對(duì)極性化合物及其雜質(zhì)的分析項(xiàng)目而開發(fā)的五氟苯基（PFPP）色譜柱、HILIC色譜柱等，針對(duì)異構(gòu)體的分離而開發(fā)的二苯基柱等。本文結(jié)合自己的工作經(jīng)驗(yàn)及對(duì)色譜柱的一些認(rèn)識(shí)進(jìn)行了簡(jiǎn)要的匯總，分鍵合基質(zhì)、鍵合相、色譜柱說明書解析、色譜柱的應(yīng)用及維護(hù)等五個(gè)方面進(jìn)行介紹。

 

 

二、鍵合基質(zhì)

 

色譜柱鍵合基質(zhì)分為硅膠基質(zhì)、聚合物基質(zhì)等，其中硅膠基質(zhì)應(yīng)用最為廣泛，分為全多孔硅膠微粒、雜化硅膠顆粒和實(shí)心核硅膠顆粒。

 

1、全多孔硅膠基質(zhì)

 

全多孔硅膠，以其全多孔的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)具有很高的比表面積，故具有很高的柱效。其機(jī)械強(qiáng)度大的特點(diǎn)可保證填充床長(zhǎng)時(shí)間在很高的操作壓力下工作，柱效保持穩(wěn)定，同時(shí)剛性、高強(qiáng)度的微粒還使柱子的反壓較低，壽命較長(zhǎng)。安捷倫色譜柱硅珠堆砌技術(shù)（專利），以ZORBAX為代表，Waters的Sunfire、Atlantis為硅膠基質(zhì)色譜柱。

 

硅膠基質(zhì)，作為HPLC色譜柱的擔(dān)體，并非完美，其特點(diǎn)主要包括以下3方面：

（1）低pH值，硅膠鍵合鍵容易水解(pH<2)；高pH值，硅膠容易溶解（pH>8），分別見圖1和圖2。

（2）在接近中性的條件時(shí)，硅醇基裸露，顯酸性，不適宜分離堿性化合物。

（3）某些硅膠被一定金屬污染，這些金屬會(huì)引起峰的不對(duì)稱或拖尾，甚至化合物的死吸附。

圖1

 

圖2

 

2、雜化硅膠顆粒基質(zhì)

 

為改善純硅膠基質(zhì)的不足，雜化硅膠顆粒應(yīng)運(yùn)而生，具有高穩(wěn)定性、耐受pH及高機(jī)械強(qiáng)度的特性，能夠改善高pH值條件下硅膠內(nèi)部水解的問題。Waters公司先后開發(fā)了兩代無機(jī)/有機(jī)雜化顆粒技術(shù)（HPT與BEH技術(shù)）。

 

HPT技術(shù)

第一代雜化硅膠合成XTerra®，硅甲基鍵合，即HPT顆粒雜化技術(shù)，使用超純四乙氧基硅氧烷與甲基三乙氧基硅氧烷作為起始物料合成甲基聚乙氧基硅烷，從而實(shí)現(xiàn)在合成基材的同時(shí)，對(duì)部分硅羥基進(jìn)行封端。具有較好的機(jī)械強(qiáng)度，高球形物態(tài)，與高純硅膠基質(zhì)相比，可改善堿性分析物的拖尾因子的同時(shí)，也提高了對(duì)高pH條件的耐受性。

 

合成見圖3：

圖3

 

BEH技術(shù)

 

第二代雜化硅膠合成XBridge®，亞乙基橋鍵合，即BEH雜化顆粒技術(shù)，它是由兩種高純度單體——四乙氧基甲硅烷和雙（三乙氧基甲硅烷）乙烷制作而成的顆粒，具有極高的機(jī)械強(qiáng)度，比內(nèi)嵌甲基的第一代HPT技術(shù)具有更高的交聯(lián)度；Si-CH2-CH2-Si的高化學(xué)穩(wěn)定性以及高疏水性，使得BEH雜化顆粒對(duì)于高pH條件具有更高的耐受性。見圖4：

圖4

 

基于上述技術(shù)，使鍵合硅膠基質(zhì)的pH耐受范圍更寬，機(jī)械強(qiáng)度更高，柱效佳。安捷倫以StableBond、Eclipse 等代表著雜化硅膠的類型及封端技術(shù)。

 

3、實(shí)心核硅膠顆?；|(zhì)

 

實(shí)心核顆粒，即表面多孔實(shí)心核顆粒，waters推出了CORTECS分為2.7μm、1.6μm等粒徑，與全多孔硅膠比較，由于顆粒密度大、顆粒大小分布窄，傳質(zhì)阻抗、渦流擴(kuò)散降至最低，從而柱效較高，個(gè)人的體驗(yàn)為峰容易過載，多次進(jìn)樣后柱壓升高。

 

三、鍵合相

 

色譜柱鍵合相的種類很多，如鍵合型離子交換劑、手性固定相及親和色譜固定相等，但是最常用的是反相和正相鍵合相色譜法中的化學(xué)鍵合相，按照所鍵合基團(tuán)的極性可將其分為非極性、弱極性和極性三類。本節(jié)以非極性鍵合基團(tuán)（C18/C8）為例，進(jìn)行介紹。

 

不同碳鏈的影響：非極性鍵合相的烷基鏈長(zhǎng)對(duì)溶質(zhì)的保留、選擇性和載樣量都有影響。長(zhǎng)鏈烷基可是溶質(zhì)的K增大，分離選擇性改善，使載樣量提高，長(zhǎng)鏈烷基鍵合相的穩(wěn)定性也更高。

 

不同配體鍵合：該鍵合工藝適應(yīng)于大部分的鍵合相，C18可分為單鍵鍵合、雙鍵鍵合和三鍵鍵合，C18又可分為普通C18和內(nèi)嵌極性配體等，單鍵鍵合的優(yōu)點(diǎn)為鍵合密度高，樣品載樣量大，缺點(diǎn)為疏水性最強(qiáng)，對(duì)極性化合物保留不佳；容易發(fā)生酸水解鍵合相流失。

三鍵鍵合的優(yōu)點(diǎn)為酸性條件下鍵合相穩(wěn)定性高，其缺點(diǎn)為為鍵合密度較低，樣品載樣量小。

帶有內(nèi)嵌極性配體的色譜填料，由于其特殊親和性及屏蔽效應(yīng)，使之具有如下性能：1、耐受100%的水相2、使堿性化合物的峰型更完美3、增加親水化合物的保留，使之具有不同的選擇性。

 

不同的含碳量

含碳量越高，固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加，高含碳量，有利于不易保留化合物的分離，水解穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好；低含碳量，有利于分析有一定保留的化合物，降低溶劑損耗、減少運(yùn)行時(shí)間。

 

粒度大小、形狀及孔結(jié)構(gòu)

顆粒度越小，柱效越高（傳質(zhì)好，渦流擴(kuò)散小），柱壓越高（滲透性差）。顆粒的形狀分為球型和無定型，其中球型形狀柱效高、重現(xiàn)性好，柱床結(jié)構(gòu)均勻；無定型的柱床結(jié)構(gòu)不均勻，流動(dòng)相線性速度不均勻，譜帶擴(kuò)展。關(guān)于硅膠的孔結(jié)構(gòu)，對(duì)于小分子（分子量<2000)，通常孔徑為80-120Å。120Å代表著多孔硅膠小孔的平均孔徑，小分子可輕易擴(kuò)散進(jìn)入80-120Å孔徑的填料，但較大的多肽和蛋白質(zhì)則不能，建議用300Å。

 

比表面積

比表面積大，保留增加，載樣量增加，平衡時(shí)間增加，（梯度洗脫尤為注意）。

 

四、色譜柱說明書舉例

 

以Waters的XBridge為例。

解析1：XBridgeShield RP185μm，XBridge為第二代雜化硅膠顆粒（亞乙基橋鍵合），pH可耐受2-12；shieldRP18為內(nèi)嵌極性基團(tuán)C18，可完全兼容100%水相，屏蔽硅醇基，對(duì)堿性化合物峰形更佳。

 

 

解析2：由說明書表格內(nèi)容可知

非鍵合粒子參數(shù)	結(jié)果	鍵合粒子參數(shù)	結(jié)果
90%/10%粒子直徑比	1.64	總碳量	16.61
孔隙容積(cm3/g)	0.76	表面濃度（μmol/m2）	3.25
比表面積(m2/g)	189	Al(ppm)	<1
相比率（m2/cm3）	118	Fe(ppm)	3
平均孔徑	146	Na(ppm)	<1

 

粒子直徑比，影響柱壓；比表面積189（范圍160-450）、較低，保留較弱，載樣量偏低，平衡時(shí)間較短；總碳量為16.61，含碳量較高（范圍8-25），保留強(qiáng)，分離度更好，適用于極性化合物的分離；平均孔徑為146Å（范圍80-120Å），適用于小分子化合物的分離。

 

五、色譜柱的應(yīng)用(以C18為例)

 

1、對(duì)于極性較大化合物的分離

WatersAtlantis T3 在增強(qiáng)極性化合物保留能力的同時(shí)，維持了對(duì)中等和強(qiáng)疏水性化合物的適度保留能力，100%水相流動(dòng)相的兼容。

XBridgeShield RP18 極性嵌入基團(tuán)，增加極性化合物的保留，可兼容100%的水相，由于硅醇基的屏蔽作用，對(duì)堿性化合物的峰形更佳。

 

 

XBridge/Atlantis  HILIC 適用于強(qiáng)極性堿性水溶性化合物，可以提供和反相不同的分離選擇性。

 

 

ZORBAX StableBond-Aq，專利鍵合技術(shù)，pH可低至1，適用于高酸性流動(dòng)相，100%純水相，適用于強(qiáng)極性樣品的分離。

 

 

2、對(duì)于弱堿性化合物的分離

SunFireC18 色譜柱為超純硅膠，具有極高的載樣量，適合于中低PH流動(dòng)相條件下化合物的分離與制備，特別是針對(duì)堿性化合物，峰型好。

 

ZORBAXEclipse Plus C18，改進(jìn)的雙封端技術(shù)(二甲基鍵合，雙封端)，針對(duì)堿性化合物而特別研制的色譜柱。 

ZORBAX Extend- C18 專利雙齒鍵合技術(shù)，為高pH流動(dòng)相設(shè)計(jì)，可用于pH2-11.5，適用于堿性化合物的分離。

 

 

ZorbaxBonus RP 極性酰胺鍵合相，耐受高水相比例，適用于高水相分離堿性化合物。

 

 

六、色譜柱的維護(hù)

 

色譜柱峰形發(fā)生改變、壓力升高等，意味著色譜柱需要清洗或再生，采用高水相可以清洗系統(tǒng)中的緩沖鹽，采用高有機(jī)相可以清洗大部分強(qiáng)保留的化合物。若無法解決問題，可根據(jù)樣品的性質(zhì)及污染物的性質(zhì)參照下表選擇清洗方法。

備注：四氫呋喃不常用，儀器的管路和密封所用的材料部分為PEEK的，而這種材料對(duì)四氫呋喃很敏感，如大濃度或長(zhǎng)時(shí)間使用，會(huì)加快PEEK材料的老化，造成管路與密封失去任性，變硬變脆，很容易損壞儀器。針對(duì)出入口篩板孔徑一致的色譜柱（絕大多數(shù)的5μm粒徑色譜柱），也可以嘗試0.2ml/min低流速長(zhǎng)時(shí)間反沖。但對(duì)于小于3.5μm小粒徑的色譜柱，不建議反沖。

 

[參考文獻(xiàn)]

[1] 安捷倫液相色譜柱介紹與選擇（培訓(xùn)資料）

[2] Waters-HPLC 色譜柱應(yīng)用基礎(chǔ)_2016

[3] 色譜柱維護(hù)與使用指南