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近期，武漢理工大學(xué)戴紅蓮教授和涂溶教授在科愛(ài)創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上發(fā)表文章：基于沒(méi)食子酸-鎂金屬有機(jī)框架的可噴涂水凝膠，持續(xù)調(diào)節(jié)糖尿病傷口氧化應(yīng)激微環(huán)境并促進(jìn)神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)重建。目前，糖尿病傷口治療的面臨高氧化應(yīng)激水平和持續(xù)炎癥導(dǎo)致愈合緩慢及后期神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)難以重建。針對(duì)這一難題，作者提出了一種通過(guò)沒(méi)食子酸-鎂金屬有機(jī)框架（Mg-GA MOF）持續(xù)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激微環(huán)境的策略，并基于海藻酸鈉（SA）/殼聚糖季銨鹽（HACC）開(kāi)發(fā)了可噴涂水凝膠敷料來(lái)治療糖尿病傷口。殼聚糖季銨鹽具有抗菌性能，可預(yù)防創(chuàng)面細(xì)菌感染。具有類(lèi)酶催化功能的Mg-GA MOF在早期快速清除活性氧并加速M(fèi)1型巨噬細(xì)胞向M2型的極化。修復(fù)后期維持氧化還原平衡并通過(guò)鎂離子輔助治療促進(jìn)血管再生和神經(jīng)元形成?？蓢娡克z敷料通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)重建，加速上皮再生和膠原蛋白沉積，快速修復(fù)糖尿病傷口。

 

慢性糖尿病傷口是糖尿病患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥。高氧化應(yīng)激水平會(huì)延長(zhǎng)炎癥期并對(duì)細(xì)胞造成氧損傷阻礙血管神經(jīng)再生，其影響糖尿病傷口的整個(gè)愈合過(guò)程，仍是治療糖尿病傷口一大挑戰(zhàn)。清除過(guò)量活性氧是加速慢性糖尿病創(chuàng)面修復(fù)的有效策略之一。天然多酚（例如:單寧酸、沒(méi)食子酸、茶多酚等）是生物相容性良好的抗氧化劑和抗炎劑，但酚羥基的不穩(wěn)定性及無(wú)法長(zhǎng)期持續(xù)催化極大程度上限制了多酚基材料的應(yīng)用。因此，如何提高多酚材料在治療慢性糖尿病傷口中的催化效率以持續(xù)降低氧化應(yīng)激水平，并增強(qiáng)修復(fù)后期血管和神經(jīng)的網(wǎng)絡(luò)重建是促進(jìn)糖尿病傷口快速愈合的關(guān)鍵?；诖?，本研究利用微波輔助合成技術(shù)優(yōu)化bio-MOF的合成方法，獲得單分散且形貌均勻的沒(méi)食子酸-鎂金屬有機(jī)框架（Mg-GA MOF），提高其水中穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了Mg-GA MOF合成-結(jié)構(gòu)-性能之間的有效調(diào)控，并將其負(fù)載在具有可預(yù)防細(xì)菌感染的可噴涂水凝膠中構(gòu)建了新型抗菌凝膠噴霧用于糖尿病傷口修復(fù)。在傷口修復(fù)的早期階段，Mg-GA MOF釋放的GA迅速清除ROS，降低氧化應(yīng)激水平，實(shí)現(xiàn)高效抗炎。在傷口修復(fù)后期，Mg-GA MOF在生物降解過(guò)程中不斷釋放GA和Mg2+，以維持氧化還原平衡的同時(shí)通過(guò)鎂離子輔助治療激活血管相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管再生和神經(jīng)元形成。此外，在可噴涂水凝膠中加入殼聚糖季銨鹽（HACC）是一種有效的抗菌成分，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的抑制和消除。具有抗菌、抗氧化和炎癥調(diào)節(jié)功能的可噴水凝膠敷料通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)重建，加速再上皮化和膠原蛋白沉積來(lái)快速修復(fù)糖尿病傷口（圖1）。

 

圖1.（a）Mg-GA MOF的合成，（B）含Mg-GA MOF的可噴涂水凝膠敷料的合成，以及（C）促進(jìn)慢性糖尿病傷口修復(fù)的機(jī)制示意圖

 

一、Mg-GA MOF的形貌調(diào)控及連續(xù)釋放沒(méi)食子酸

 

生物MOF材料已被廣泛研究和應(yīng)用，但其在水中的不穩(wěn)定性是制約其發(fā)展的關(guān)鍵因素。通常，穩(wěn)定的MOF結(jié)構(gòu)具有更廣泛的應(yīng)用潛力?，F(xiàn)有合成方法的基礎(chǔ)上，采用微波輔助合成技術(shù)制備沒(méi)食子酸-鎂金屬有機(jī)骨架（Mg-GA MOF），并在合成過(guò)程中加入二甲基甲酰胺（DMF）以優(yōu)化合成方法。與在高溫（>120℃）下需要較長(zhǎng)時(shí)間（12~24h）的傳統(tǒng)水熱合成法相比，該方法在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)（30min）快速獲得單分散、粒徑均勻的Mg-GA MOF。DMF的存在增強(qiáng)了溶劑的極性，加快了反應(yīng)速度。同時(shí)，DMF的水解產(chǎn)物甲酸和二甲胺分別作為調(diào)節(jié)劑和去質(zhì)子化溶質(zhì)調(diào)控Mg-GA MOF的晶體形貌。Mg-GA MOFs在20 % DMF/水體系下為雙錐體，隨著DMF濃度增加到60 %，逐漸變?yōu)榱⒎襟w，最后在80 %DMF/水溶劑體系下變?yōu)榍蝮w（圖2）。對(duì)Mg-GA MOF晶體形貌的調(diào)控提高了其在水中的穩(wěn)定性，有助于提高其催化性能。

圖2. DMF調(diào)控Mg-GA MOF晶體形貌及影響沒(méi)食子酸持續(xù)釋放

 

二、Mg-GA MOF類(lèi)酶催化體外清除ROS

 

對(duì)于慢性糖尿病傷口，過(guò)量的ROS是影響傷口愈合速度的最關(guān)鍵介質(zhì)。為了確定Mg-GA MOF是否具有模擬酶催化的能力，本研究進(jìn)行了一系列ROS清除實(shí)驗(yàn)，包括超氧陰離子（O2•-）、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥基自由基（•OH）和1,1-二苯基-2-三硝基肼基自由基（DPPH•）等典型代表。由于Mg-GA MOF對(duì)ROS的催化還原主要與配體GA和MOF的表面活性位點(diǎn)有關(guān)，因此將Mg-GA MOF與GA和常見(jiàn)的抗氧化劑抗壞血酸（維生素C）進(jìn)行比較，以評(píng)估Mg-GA MOFs清除各種自由基的能力。結(jié)果表明，具有酶催化能力的Mg-GA MOF可以清除各種活性氧自由基并維持氧化還原平衡。值得注意的是，Mg-GA MOF的類(lèi)SOD和類(lèi)CAT活性在級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)中具有潛在的清除O2•-和H2O2的優(yōu)勢(shì)。MG-GA MOF的類(lèi)CAT活性的劑量依賴性小于類(lèi)SOD活性和•OH清除的劑量依賴，有效地避免了類(lèi)SOD活性催化引起的H2O2積累和芬頓反應(yīng)導(dǎo)致額外的•OH生成（圖3）。此外，低劑量Mg-GA MOF有效清除RNS性能打破了過(guò)氧亞硝酸根陰離子（ONOO-）的積累，避免了亞硝化應(yīng)激，這種RNS很容易引起DNA斷裂和脂質(zhì)過(guò)氧化。

圖3. Mg-GA MOF具有清除ROS的酶催化功能圖

 

三、Mg-GA MOF的體外抗炎和抗氧化能力

 

對(duì)于慢性糖尿病傷口，持續(xù)的氧化應(yīng)激和受損的免疫環(huán)境是阻礙傷口愈合的關(guān)鍵。在LPS構(gòu)建的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型下，Mg-GA MOF可降低炎癥狀態(tài)下RAW264.7細(xì)胞的胞內(nèi)活性氧水平，并促進(jìn)RAW264. 7細(xì)胞M1向M2的極化。結(jié)果表明Mg-GA MOF具有體外抗炎活性。Mg-GA MOF持續(xù)釋放GA與ROS的快速反應(yīng)有效保護(hù)了暴露在H2O2氧化環(huán)境中的hUVEC，L929和HaCaT細(xì)胞，并有效降低胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平（圖4）。Mg-GA MOF的長(zhǎng)期降解實(shí)現(xiàn)了氧化應(yīng)激平衡的長(zhǎng)期維持，這對(duì)后期損傷修復(fù)的效率和后期損傷修復(fù)的功能重建至關(guān)重要。

圖4. Mg-GA MOF的體外抗炎和抗氧化能力

 

四、Mg-GA MOF促進(jìn)體外內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小管形成

 

血管生成在組織再生中起關(guān)鍵作用，取決于血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管網(wǎng)絡(luò)的重建。劃痕測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示50 μg/mL Mg-GA MOF處理組的hUVEC細(xì)胞遷移范圍顯著大于未處理組。處理24h后，Mg-GA MOF組的遷移率達(dá)到71.45%。同時(shí)體外成小管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未處理的對(duì)照組相比，Mg-GA MOF培養(yǎng)的hUVEC在兩個(gè)處理時(shí)間都可以顯著促進(jìn)小管形成。對(duì)分枝數(shù)和管長(zhǎng)的半定量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果（圖5）。綜上所述，Mg-GA MOF持續(xù)釋放的Mg2+顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增強(qiáng)體外小管形成，這在血管重建中具有潛在的關(guān)鍵作用。

圖5. Mg-GA MOF的體外成血管能力

 

五、Mg-GA MOF基可噴涂凝膠敷料制備及抗菌能力

 

為了在糖尿病傷口中有效地遞送Mg-GA MOF，本研究合成了基于Mg-GA MOF的可噴涂水凝膠敷料（Gel/MOF）。水凝膠敷料的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化是通過(guò)海藻酸鈉（SA）的水溶液和含有Mg-GA MOF的殼聚糖季銨鹽（HACC）的鈣離子溶液互噴實(shí)現(xiàn)的。霧化的SA和鈣離子溶液在約數(shù)十秒內(nèi)快速交聯(lián)（圖6A-C）。通過(guò)菌落形成單位測(cè)定（CFU）和抑菌圈實(shí)驗(yàn)評(píng)估Mg-GA MOF和Gel/MOF的抗菌效果。GA及其衍生物的抗菌性能需較高的劑量依賴（IC50~500μg/mL）且需要在溶液中釋放，導(dǎo)致Mg-GA MOF對(duì)S.aureus和E.coli抗菌效果不顯著。將陽(yáng)離子抗菌劑季銨鹽改性殼聚糖引入到Gel/MOF中，提高了水凝膠敷料的抗菌敏感性。季銨鹽吸附細(xì)菌后，水凝膠敷料中的Mg-GA MOF持續(xù)釋放GA。值得注意的是，Gel/MOF的抗菌效果主要源于陽(yáng)離子抗菌劑季銨鹽，在不添加殼聚糖季銨鹽的對(duì)照組中，即使添加GA或MOF也沒(méi)有觀察到明顯的抗菌效果（圖6）。因此，Gel/MOF在抑制傷口中的細(xì)菌增殖和預(yù)防細(xì)菌感染方面具有潛在優(yōu)勢(shì)。

圖6. Mg-GA MOF和可噴涂水凝膠敷料Gel/MOF的體外抗菌能力

 

六、可噴涂水凝膠敷料Gel/MOF促進(jìn)體內(nèi)糖尿病傷口愈合

 

為了驗(yàn)證可噴涂水凝膠敷料是否加速糖尿病傷口修復(fù)，本研究在db/db糖尿病小鼠中直徑為6 mm的全層皮膚缺損模型上對(duì)Gel/MOF進(jìn)行評(píng)價(jià)（圖7）。在手術(shù)后的前3天，組之間沒(méi)有顯著的差距。Gel/MOF組的愈合速度從手術(shù)后8天開(kāi)始顯著加快，表明Mg-GA MOF對(duì)巨噬細(xì)胞的正調(diào)節(jié)和持續(xù)釋放的GA降低ROS水平導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)口從炎癥階段轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋畴A段。與對(duì)照組和Gel組相比，Gel/MOF組傷口愈合率顯著提高，顯著加快傷口愈合速度。Gel/MOF治療16天后的再生皮膚組織組織切片H&E染色結(jié)果證實(shí)了這一結(jié)果，且再生組織與周?chē)つw組織幾乎相同，可見(jiàn)更多的血管、毛囊、皮脂腺和表皮再上皮化。除此之外，Masson染色結(jié)果及半定量分析結(jié)果顯示Gel/MOF組中呈現(xiàn)出更多的膠原沉積，同時(shí)天狼星紅染色結(jié)果顯示與對(duì)照組膠原蛋白呈黃綠色，Gel和Gel/MOF處理后膠原蛋白變?yōu)槌赛S色和鮮紅色，Gel/MOF組具有比對(duì)照組和凝膠組更高的膠原蛋白I/III比率。這些結(jié)果表明，Gel/MOF促進(jìn)表皮再上皮化及膠原沉積，并調(diào)節(jié)I型和III型膠原表達(dá)以促進(jìn)傷口愈合。

圖7. 可噴涂水凝膠敷料Gel/MOF加速體內(nèi)糖尿病傷口愈合，促進(jìn)膠原沉積和再上皮化

 

七、Gel/MOF抑制糖尿病創(chuàng)面氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)

 

本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Gel/MOF可以通過(guò)降低氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)來(lái)加速體內(nèi)炎癥—增殖轉(zhuǎn)變。對(duì)再生組織進(jìn)行胞內(nèi)總活性氧免疫熒光染色，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，術(shù)后第8天Gel和Gel/MOF處理后的ROS+細(xì)胞密度極其顯著地降低，且Gel/MOF的ROS+細(xì)胞密度顯著低于凝膠組，表明MOF的存在促進(jìn)了ROS的清除并極大地緩解了糖尿病傷口中氧化應(yīng)激的微環(huán)境。進(jìn)一步地使用RT-qPCR檢測(cè)再生皮膚組織中的炎癥相關(guān)基因，結(jié)果顯示，盡管Gel/MOF組中的TNF-α基因表達(dá)沒(méi)有顯著降低，Gel/MOF組中的抗炎因子IL-10和IL-4的表達(dá)顯著高于對(duì)照組和Gel組。此外，從Gel和Gel/M0F組提取蛋白，然后使用細(xì)胞因子蛋白陣列檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白。在Gel/MOF組中，促炎因子及相關(guān)趨化因子地表達(dá)降低，而抗炎因子IL-1ra增加（圖8）。結(jié)果均表明，在Gel敷料中加入MOF可增強(qiáng)M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化，并積極調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境，降低氧化應(yīng)激以促進(jìn)傷口愈合。

圖8. 可噴涂水凝膠敷料Gel/MOF調(diào)節(jié)糖尿病傷口中的炎性細(xì)胞因子表達(dá)并抑制氧化應(yīng)激

 

八、Gel/MOF加速神經(jīng)血管網(wǎng)重建

 

氧化應(yīng)激微環(huán)境直接影響血管和神經(jīng)再生。為了研究MOF維持氧化還原穩(wěn)態(tài)是否可以在增殖階段期間促進(jìn)血管神經(jīng)再生，研究人員檢測(cè)了再生組織的血管相關(guān)基因并對(duì)血管和神經(jīng)元進(jìn)行CD31、β3-微管蛋白和NF200免疫熒光標(biāo)記。Gel/MOF處理后HIF-1α表達(dá)與TNF-α相似。Mg-GA MOF釋放Mg2+上調(diào)Vegf和Pdgf的表達(dá)。同時(shí)，免疫熒光結(jié)果顯示Gel/MOF組可見(jiàn)大量CD31表達(dá)且在其周?chē)尸F(xiàn)大量連續(xù)條狀的β3-tubulin+著色，而對(duì)照組及Gel均較少（圖9）。這些結(jié)果表明Gel/MOF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和新血管的形成，同時(shí)伴隨著新生的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，其治療后的皮膚具有更好的修復(fù)效果。

圖9. 可噴涂水凝膠敷料Gel/MOF加速神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)重建

 

綜上所述，本研究成功制備了分散性好且形貌可調(diào)的Mg-GA MOF，實(shí)現(xiàn)了Mg-GA MOF合成-結(jié)構(gòu)-性能之間的有效調(diào)控，并將其負(fù)載至具有抗菌性能的可噴涂水凝膠敷料中，作為微環(huán)境調(diào)節(jié)劑用于治療慢性糖尿病傷口。Mg-GA MOF具有類(lèi)酶催化活性，可通過(guò)降解釋放GA快速清除ROS，維持氧化還原平衡，有效調(diào)節(jié)慢性糖尿病創(chuàng)面微環(huán)境。在傷口修復(fù)的后期，Mg2+輔助治療可促進(jìn)神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)重建，而抗菌水凝膠敷料可預(yù)防細(xì)菌感染。這種簡(jiǎn)單方便的可噴涂水凝膠敷料為慢性糖尿病傷口提供了一種非藥物治療的新策略。

 

原文信息

 

Chenxi Lian, Jiawei Liu, Wenying Wei, Xiaopei Wu, Takashi Goto, Haiwen Li, Rong Tu**, Honglian Dai, 

 

Mg-gallate metal-organic framework-based sprayable hydrogel for continuously regulating oxidative stress microenvironment and promoting neurovascular network reconstruction in diabetic wounds. 

 

Bioactive Materials, 38 (2024) 181–194. DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.04.028