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摘 要： 建立高效液相色譜波長切換法同時測定復方愈創(chuàng)木酚磺酸鉀口服溶液中苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯6種防腐劑含量。采用Waters XSelect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，甲醇作為流動相A，0.1%乙酸銨溶液（用乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.5）作為流動相B，梯度洗脫，流量為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測波長分別為226、256 nm，進樣體積為10 μL。6種防腐劑在質(zhì)量濃度0.2～28.6 μg/mL內(nèi)與色譜峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均為0.999 9，精密度試驗測試結(jié)果的相對標準偏差為0.1%～0.6%，樣品加標平均回收率為98.8%～102.2%。該方法操作簡單，專屬性強，準確度高，重復性好，可用于復方愈創(chuàng)木酚磺酸鉀口服溶液的防腐劑檢測，為生產(chǎn)企業(yè)的處方、生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標準的把控提供參考作用。

 

關(guān)鍵詞： 復方愈創(chuàng)木酚磺酸鉀口服溶液； 防腐劑； 波長切換； 高效液相色譜

 

 

復方愈創(chuàng)木酚磺酸鉀口服溶液是以鹽酸異丙嗪、愈創(chuàng)木酚磺酸鉀、氯化銨等多種組分作為原料配制而成的復方感冒藥，臨床上用于感冒及過敏性支氣管炎引起的咳嗽、多痰。鹽酸異丙嗪為抗組胺藥，能對抗過敏反應(yīng)所致的毛細血管擴張，降低毛細血管通透性，有輕度的支氣管平滑肌解痙作用，亦有明顯的中樞安定作用及一定的鎮(zhèn)咳作用；愈創(chuàng)木酚磺酸鉀是強力祛痰劑，使呼吸道腺體分泌增加，痰液被稀釋，易于咳出。氯化銨為鹽類祛痰藥，能反射性地增加呼吸道黏膜腺體的分泌，從而使痰易于咳出，有利于粘痰的清除。

多劑量口服液體制劑由于多次開啟使用，容易被微生物污染，易引起質(zhì)量的變化，往往需要加入適量的防腐劑來抑制微生物滋生[1]。苯甲酸、山梨酸及羥苯酯類均具有抑制微生物的繁殖作用，是口服溶液中常用的防腐劑[2?3]。但是防腐劑如果攝入過量會對人體產(chǎn)生一定的毒副作用，對人體的健康產(chǎn)生危害[4?5]。目前很多藥品標準中均未設(shè)置防腐劑含量測定的方法，導致藥物的監(jiān)管存在一定的難度。

目前防腐劑的測定方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[6?9]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法[10?11]、毛細管電泳(CE)法[12?13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[14?15]。GC-MS、LC-MS/MS使用成本高，且樣品處理相對復雜，對于企業(yè)來說普及性不高；CE方法樣品進樣量有限，且分離重現(xiàn)性易受電滲的影響。筆者采用HPLC波長切換法，對于測定不同種類的防腐劑來說靈敏度高，響應(yīng)好，采用梯度洗脫能更好的分離6種防腐劑。在廠家提供的處方中發(fā)現(xiàn)，不少廠家都添加了苯甲酸或苯甲酸鈉、羥苯乙酯作為防腐劑，為了考察其添加的量是否在規(guī)定的范圍之內(nèi)，筆者根據(jù)6種防腐劑的特征，建立了HPLC波長切換法測定復方愈創(chuàng)木酚磺酸鉀口服溶液中6種防腐劑的含量，為該口服溶液防腐劑的控制、篩查提供參考依據(jù)。

 

 

1、 實驗部分

 

 

1.1 主要儀器與試劑

電子分析天平：XD205DU型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，配DAD檢測器、ChemStation工作站，美國安捷倫科技有限公司。

超純水儀：Milli-Q3800型，美國密里博公司。

苯甲酸對照品、山梨酸對照品、羥苯甲酯對照品、羥苯乙酯對照品、羥苯丙酯對照品、羥苯丁酯對照品：質(zhì)量分數(shù)分別為99.9%、99.6%、99.9%、99.9%、99.6%、99.8%，中國食品藥品檢定研究院。

復方愈創(chuàng)木酚磺酸鉀口服溶液樣品：共99個批次，來自全國14個生產(chǎn)企業(yè)。

甲醇、乙腈：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司。

乙酸銨：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters XSelect HSS T3柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國沃特世科技有限公司)；柱溫：26 ℃，進樣量：10 μL；檢測波長：226 nm (苯甲酸)和256 nm (山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和羥苯丁酯)；流動相：以甲醇作為流動相A，以0.1%乙酸銨溶液(用乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.5)作為流動相B，流量為1.0 mL/min；梯度洗脫，洗脫程序詳見表1。

表1   梯度洗脫程序

Tab. 1   Gradient elution procedure

 

1.3 溶液配制

混合對照品儲備液：分別精密稱取苯甲酸11.44 mg、山梨酸10.84 mg、羥苯甲酯10.77 mg、羥苯乙酯10.72 mg、羥苯丙酯10.73 mg、羥苯丁酯10.81 mg，置于同一20 mL容量瓶中，加入20%（體積分數(shù)，下同）乙腈水溶液使溶解并稀釋至標線，每種防腐劑的質(zhì)量濃度約為500 μg/mL。

混合對照品溶液：精密量取混合對照品儲備液1 mL，置于20 mL容量瓶中，加入20%乙腈水溶液稀釋至標線。

系列混合標準工作溶液：精密吸取混合對照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，用20%乙腈水溶液稀釋至標線，搖勻，然后精密量取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分別置于不同10 mL容量瓶中，用20%乙腈水溶液定容置標線，配制成系列混合標準工作溶液。

樣品溶液：取復方愈創(chuàng)木酚磺酸鉀口服溶液樣品0.2 mL，置于100 mL容量瓶中，加入20%乙腈水溶液定容至標線。

陰性空白溶液：按處方比例制備不含苯甲酸、山梨酸及羥苯酯類的空白輔料，按處方配比精密取樣，置于100 mL容量瓶中，加水使溶解并定容至標線，作為陰性空白儲備溶液；精密量取1 mL，置于100 mL容量瓶中，加水定容至標線。

1.4 實驗方法

取混合對照品溶液、系列混合標準工作溶液、樣品溶液、陰性空白溶液及20%乙腈水溶液，按照1.2色譜條件進行試驗分析，記錄色譜圖及色譜峰面積，按外標法計算6種防腐劑的含量。

 

2、 結(jié)果與討論

 

2.1 流動相組成的考察

考察流動相為甲醇-水和乙腈-水組成時測定結(jié)果的差異發(fā)現(xiàn)，用甲醇作為有機相時各色譜峰的峰型比較好。再考察流動相為甲醇-水和甲醇-0.1%乙酸銨溶液組成時測定結(jié)果的差異發(fā)現(xiàn)，在水中加入0.1%乙酸銨有助于分離度的提高，同時拖尾因子減小，更有利于測定。羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯在流動相為甲醇-0.1%乙酸銨溶液(體積比為55∶45)時出峰時間很慢，需要增加甲醇的比例才能洗脫出來，因此選擇了梯度洗脫的模式?？疾?.1%乙酸銨溶液不同pH值(3.0、3.5、4.0、5.0)對測定的影響，結(jié)果顯示甲醇-0.1%乙酸銨溶液(乙酸調(diào)pH值為4.5)為流動相時，峰型好且出峰時間適宜，分離度較好，理論塔板數(shù)高。

2.2 檢測波長的選擇

分別提取苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯的DAD掃描圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苯甲酸最大吸收為226 nm，羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯最大吸收為256 nm。安捷倫1260液相色譜儀可以選擇多個通道同時測定，也可選擇在某個時間段進行波長切換測定，因此苯甲酸出峰后直接切換成256 nm，從而能夠滿足6個防腐劑都在最大吸收波長處測定，以便結(jié)果的分析。

2.3 專屬性考察

取1.3項下的混合對照品溶液、加標樣品溶液、陰性空白溶液，在1.2色譜條件下分別進樣測定，記錄色譜圖見圖1。混合對照品溶液中6種防腐劑的分離度均大于5.0，樣品溶液中各色譜峰的分離度均大于2.0，陰性空白溶液不干擾測定。

圖1   HPLC典型色譜圖

Fig. 1   Typical chromatogram of HPLC

1—苯甲酸； ；2—山梨酸；　3—羥苯甲酯；4—羥苯乙酯；　5—羥苯丙酯；　6—羥苯丁酯

 

2.4 線性關(guān)系

取系列混合標準工作溶液，按1.2色譜條件進樣，測定各色譜峰面積。分別以防腐劑峰面積y為縱坐標，對照品質(zhì)量濃度x (μg/mL)為橫坐標，繪制標準工作曲線，計算線性回歸方程。將進樣得到的信噪比，折算當信噪比S/N=3時的質(zhì)量濃度確定為檢出限，結(jié)果見表2。

表2   六種防腐劑的線性關(guān)系

Tab. 2   Linear relationship of six preservatives

 

2.5 穩(wěn)定性試驗

取混合對照品溶液，于室溫放置，分別于第0、1、2、4、8、16、24 h時進樣測定，測定各防腐劑的色譜峰面積，按外標法計算所測得的苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯的含量及相對標準偏差(RSD)，見表3。表3結(jié)果表明，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3   穩(wěn)定性試驗結(jié)果

Tab. 3   Result of stability test

 

2.6 精密度試驗

精密量取陰性空白溶液0.2 mL，加入混合對照品儲備液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，用20%乙腈水溶液定容至標線，平行配制6份，按1.2色譜條件進樣，記錄峰面積，結(jié)果見表4。由表4可見，苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯，羥苯丙酯，羥苯丁酯的RSD為0.1%～0.6%，表明該方法精密度良好。

表4   方法精密度試驗結(jié)果

Tab. 4   Method precision test results

 

2.7 樣品加標回收試驗

用混合對照品儲備液作為加標回收標液，精密量取加標回收標液0.8、1.0、1.2 mL，每個濃度水平取3份，共9份，分別加入陰性空白溶液0.2 mL，置于100 mL容量瓶中，加入20%乙腈水溶液，定容至標線。按1.2色譜條件測定各防腐劑的色譜峰面積，并計算回收率，結(jié)果見表5。各防腐劑的平均回收率為98.8%～102.2%，表明樣品加標回收率良好。

表5   樣品加標回收試驗結(jié)果

Tab. 5   Sample recovery test results

 

3、 結(jié)論

 

 

用Waters XSelect HSS T3柱，以甲醇作為流動相A，0.1%乙酸銨溶液(用乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.5)作為流動相B，流量為1.0 mL/min；進行梯度洗脫，檢測波長為226 nm (苯甲酸)和256 nm (山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和羥苯丁酯)，經(jīng)方法學驗證，用該方法同時測定6種防腐劑，操作簡單，分離度好，靈敏度高，為復方愈創(chuàng)木酚磺酸鉀口服溶液防腐劑的控制、篩查提供參考依據(jù)，進一步加強藥品監(jiān)管，提高藥品質(zhì)量，從而保證藥品的抑菌效力。

 

 

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