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摘 要： 建立高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜定量分析荔枝中降糖氨酸A和亞甲基環(huán)丙基甘氨酸兩種降糖氨酸的測定方法。荔枝樣品以90%乙醇為提取溶劑進(jìn)行超聲提取，離心取上清，氮吹后用水復(fù)溶。經(jīng)丹磺酰氯衍生化后，采用Waters HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）進(jìn)行分離，柱溫為35 ℃，水（含0.1%甲酸）和乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，流量為0.3 mL/min。質(zhì)譜采用電噴霧電離源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測。兩種降糖氨酸的質(zhì)量濃度在0.01～0.50 μg/mL范圍內(nèi)與其色譜峰面積線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，降糖氨酸A的檢出限為0.05 mg/kg，亞甲基環(huán)丙基甘氨酸的檢出限為0.08 mg/kg，加標(biāo)回收率為81.4%～98.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～5.9%（n=6）。該方法操作簡單，分析時(shí)間短，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，為荔枝中降糖氨酸A和亞甲基環(huán)丙基甘氨酸兩種降糖氨酸的測定提供了有效的技術(shù)手段。

 

關(guān)鍵詞： 高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法； 荔枝； 降糖氨酸A； 亞甲基環(huán)丙基甘氨酸

 

 

1995年開始，印度荔枝主要產(chǎn)區(qū)穆扎法爾布爾地區(qū)每年5～6月份陸續(xù)報(bào)道在兒童中發(fā)生一種原因不明的神秘腦病[1?2]。2014年，這種疾病大爆發(fā)，390名患病兒童中，有122人死亡[3?5]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，疫情發(fā)生在荔枝主要產(chǎn)區(qū)，病例從5月份開始出現(xiàn)，集中在6月份的荔枝成熟季節(jié)，到7月份陸續(xù)消失[6]。近些年，國內(nèi)有報(bào)道吃荔枝能引起“荔枝病”[7?8]。“荔枝病”是一種由于空腹時(shí)大量食用荔枝引發(fā)的“低血糖癥”，已導(dǎo)致多名兒童死亡。

荔枝中所含的糖是果糖，必須經(jīng)由人體轉(zhuǎn)化為葡萄糖后，才能被吸收利用。如果過量食入荔枝，人體內(nèi)的轉(zhuǎn)化酶就會(huì)供不應(yīng)求，過量的果糖無法轉(zhuǎn)化成葡萄糖，荔枝還會(huì)刺激胰島細(xì)胞釋放大量胰島素，引發(fā)低血糖反應(yīng)。“荔枝病”患病者常伴有低血糖、癲癇癥狀甚至死亡，這可能與荔枝中含有降糖氨酸A(HGA)和亞甲基環(huán)丙基甘氨酸(MCPG)兩種物質(zhì)有關(guān)，這兩種物質(zhì)都屬于環(huán)丙基氨基酸類[9?10]。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙基氨基酸能促進(jìn)胰臟分泌胰島素，增強(qiáng)胰島素受體的敏感性，同時(shí)還可以增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2 (Glut-2)的含量，抑制某些代謝酶，影響其他能量物質(zhì)轉(zhuǎn)化成糖，甚至影響脂肪酸的氧化，導(dǎo)致肝脂肪變性。當(dāng)人體內(nèi)的糖原耗竭后，大腦就會(huì)因缺乏能量物質(zhì)，發(fā)生低血糖性腦病[11?13]。目前，國際上多采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定荔枝中HGA和MCPG的含量[14?17]，而國內(nèi)有關(guān)上述兩種物質(zhì)的檢測方法鮮有報(bào)道。考慮到兩種目標(biāo)化合物的相對(duì)分子質(zhì)量較小，水溶性極強(qiáng)，在反相色譜柱上基本不保留，測定時(shí)易受荔枝中水溶性雜質(zhì)的干擾，常規(guī)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法并不能夠很好地滿足檢測需求，因此筆者采用衍生化方式，建立快速、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)的方法檢測荔枝中HGA和MCPG，對(duì)加強(qiáng)市場監(jiān)管和保障人民群眾健康起到積極的作用。

 

 

1、 實(shí)驗(yàn)部分

 

 

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：6460型，配有AJS-ESI離子源，美國安捷倫公司。

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：CF16RXII型，日本日立公司。

多用途渦旋混合器：SAS型，英國斯圖爾特公司。

超聲波清洗器：KQ3200型，上海昆山超聲儀器有限公司。

氮吹儀：MFV-24型，廣州得泰儀器科技有限公司。

電子天平：Quintix型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司。

HGA：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.8%，批號(hào)為ALT805459，天津阿爾塔科技有限公司。

MCPG：質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，批號(hào)為1-JRH-164-1，加拿大TRC公司。

乙腈、乙醇、甲酸；均為質(zhì)譜級(jí)，美國賽默飛世爾科技有限公司。

丹磺酰氯：色譜級(jí)，美國默克公司。

碳酸鈉、鹽酸甲胺：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

荔枝、紅毛丹樣品：荔枝產(chǎn)地廣州，紅毛丹產(chǎn)地云南。

實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)過濾的超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Water HSS T3 C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國沃特世公司)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：A相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液，B相為乙腈，梯度洗脫程序：0～5 min，20%→80%乙腈；5～7 min，80%乙腈；7～7.1 min，80%→20%乙腈；7.1～8 min，20%乙腈，流量為0.3 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(AJS-ESI源)；電離方式：正離子；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；干燥器溫度350 ℃；干燥器流量8 L/min；霧化器壓力206.8 kPa；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；MRM監(jiān)測離子對(duì)參數(shù)見表1。

表1   兩種分析物質(zhì)譜參數(shù)

Tab. 1   MS/MS determination parameters of the two analytes

注：*為定量離子

 

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確適量稱取HGA、MCPG固體標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水溶解，配制成質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存。分別準(zhǔn)確移取上述兩種單標(biāo)儲(chǔ)備液適量，用去離子水逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為100、200、500、1 000、2 000、5 000 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用前現(xiàn)配。

基系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：取紅毛丹可食用部分，粉碎并充分勻漿，混合均勻。分別稱取勻漿后的試樣1 g (精確至0.001 g) 6份，置于15 mL離心管中，各自精密加入100、200、500、1 000、2 000、5 000 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，按照1.4.1樣品處理步驟處理，最終得到質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200、500 μg/L的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品處理

取荔枝可食用部分，粉碎并充分勻漿，混合均勻。分別稱取勻漿后的試樣1 g (精確到0.001 g) 6份，置于15 mL離心管中，加入90%乙醇3 mL，渦旋混勻1 min，超聲提取20 min，再用無水乙醇定容至10 mL，搖勻。以10 000 r/min離心10 min后，精密吸取上清液5 mL于另一支15 mL離心管中，氮吹濃縮至1 mL左右，用去離子水定容至5 mL，搖勻，作為樣品提取液備用。

準(zhǔn)確移取0.5 mL樣品提取液，加入碳酸鈉緩沖液(80 mmol/L，pH值為9.5) 0.5 mL，丹磺酰氯衍生化試劑(1.5 mg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配) 0.5 mL于3 mL EP管中，充分混合后，室溫避光衍生反應(yīng)20 min (期間搖晃1次)，再加入0.05 mL鹽酸甲胺溶液(20 mg/mL)渦旋混合，終止反應(yīng)。以10 000 r/min離心10 min后，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，上機(jī)測定。衍生物在4 ℃以下可避光保存72 h。

1.4.2 樣品測定

按儀器參考條件設(shè)定，將系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液等體積進(jìn)樣測定，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積，以HGA和MCPG基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，外標(biāo)法定量。

 

2、 結(jié)果與討論

 

2.1 樣品處理?xiàng)l件的選擇

HGA和MCPG是兩種非蛋白質(zhì)氨基酸，易溶于水和乙醇中。同時(shí)，荔枝中又含有大量的多糖類和纖維組織，為最大程度提取目標(biāo)化合物，減少干擾組分，研究選擇90%乙醇進(jìn)行提取?？紤]到兩種氨基酸相對(duì)分子質(zhì)量較小，極性較大，不易在反相色譜柱上保留，因此選擇丹磺酰氯試劑進(jìn)行衍生化處理，衍生化原理詳見圖1。

圖1   兩種分析物的衍生化反應(yīng)原理

Fig. 1   Principle of derivatization reaction of the two analytes

對(duì)兩種降糖氨酸的衍生化條件進(jìn)行了探索，選擇碳酸鈉緩沖體系分別為8.5、9.5、10.5三個(gè)pH值條件，選擇25、40、60 ℃三個(gè)溫度條件，選擇10、20、30、40、60、120 min 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)考察最優(yōu)化的衍生化條件。最終發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物(質(zhì)量濃度200 μg/L)在pH值為9.5、室溫條件下，達(dá)到的響應(yīng)峰值最高，且所需反應(yīng)時(shí)間最短，20 min即可反應(yīng)完全。不同衍生化時(shí)間的響應(yīng)強(qiáng)度見圖2。

圖2   兩種分析物不同衍生化時(shí)間響應(yīng)強(qiáng)度對(duì)比

Fig. 2   Comparison of response intensity of two analytes with different derivatization time

2.2 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

考察了HPLC系統(tǒng)中常用的Waters BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)。結(jié)果表明，Waters HSS T3柱分離效果較好，理論塔板數(shù)較高，且化合物的峰形完好。另外，在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸能夠提高目標(biāo)物質(zhì)離子化效率，從而增強(qiáng)化合物響應(yīng)，因此在水相流動(dòng)相中加入0.1%甲酸，增強(qiáng)目標(biāo)物質(zhì)靈敏度。兩種目標(biāo)物的色譜圖詳見圖3。

圖3   兩種分析物基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖和MRM色譜圖

Fig. 3   Total ion chromatograms and MRM chromatograms of the two compounds standard solution

選擇200 μg/L混合溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過設(shè)置不同梯度的去簇電壓和碰撞能，采用兩通進(jìn)樣方式對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行質(zhì)譜條件的摸索，主要包括子離子的選擇，去簇電壓的優(yōu)化和碰撞能的優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，去簇電壓對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)影響較小，而碰撞能對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)有一定影響。兩種化合物均選擇出四個(gè)子離子碎片，結(jié)合響應(yīng)強(qiáng)度和碰撞能的優(yōu)化，最終選擇170.1的碎片離子作為定量離子，157.1的碎片離子作為定性離子，目標(biāo)化合物優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。碰撞能優(yōu)化過程詳見圖4。

 

圖4   兩種分析物響應(yīng)強(qiáng)度-碰撞能變化趨勢(shì)

Fig. 4   The change trend of response intensity-collision energy of two analytes

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，質(zhì)譜檢測易受基質(zhì)效應(yīng)的影響，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。紅毛丹俗稱毛荔枝，和荔枝均屬無患子科植物，兩者屬“近親”關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，紅毛丹本底中未檢出兩種待測目標(biāo)化合物成分，基質(zhì)空白色譜圖詳見圖5。

圖5   紅毛丹基質(zhì)空白總離子流圖和MRM色譜圖

Fig. 5   Total ion chromatograms and MRM chromatograms of rambutan matrix

紅毛丹適合用作基質(zhì)效應(yīng)的考察對(duì)象，在進(jìn)行定量測定時(shí)平行制備基質(zhì)校準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計(jì)算基質(zhì)校準(zhǔn)曲線線性方程斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程斜率之比，來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的程度。計(jì)算公式：

ME = (k2/k1) × 100%

式中：k1——溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程斜率；

k2——基質(zhì)校準(zhǔn)曲線線性方程斜率。

一般來說，ME在85%～120%時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)，在實(shí)際檢測中可以忽略基質(zhì)效應(yīng)；反之則應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)對(duì)實(shí)際檢測的影響，在實(shí)際檢測中應(yīng)采用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線代替溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行準(zhǔn)確定量。紅毛丹基質(zhì)中兩種化合物的ME計(jì)算見表2。由表2可見，HGA和MCPG均存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，在實(shí)際檢測中應(yīng)制備基質(zhì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量檢測。

表2   兩種分析物的基質(zhì)效應(yīng)

Tab. 2   Matrix effect results for the two analytes

 

 

 

2.4 線性范圍和檢出限

采用HPLC-MS/MS質(zhì)譜對(duì)荔枝中HGA和MCPG兩種降糖氨酸類成分進(jìn)行定量分析，以紅毛丹為空白基質(zhì)制作基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，以目標(biāo)物的色譜峰面積為縱坐標(biāo)y，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，繪制校準(zhǔn)曲線。兩種化合物在曲線范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。當(dāng)實(shí)際樣品取樣量為1 g，定容體積為10 mL，以信噪比為3和10時(shí)的進(jìn)樣質(zhì)量濃度點(diǎn)為儀器的檢出限和定量限，最終計(jì)算方法檢出限為HGA 0.05 mg/kg、MCPG 0.08 mg/kg；定量限為HGA 0.1 mg/kg、MCPG 0.2 mg/kg，見表3。

表3   兩種分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限、定量限

Tab. 3   Linear equation, correlation coefficient, linear range and detection limit, quantification limit of two analytes

 

2.5 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)率

取荔枝樣品一批，平行稱樣6份，每份稱取約1.0 g，分別作為低、中、高三個(gè)濃度水平的加標(biāo)本底，三個(gè)濃度水平分別加入質(zhì)量濃度為5 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100、200、400 μL，每個(gè)水平取樣3次，按該方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。由表4可見，兩種降糖氨酸類物質(zhì)的平均回收率為81.4%～98.7%，測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～5.9%，滿足痕量物質(zhì)的檢測需求。

表4   兩種分析物的加標(biāo)回收率結(jié)果

Tab. 4   Results of spiked recovery rates for two analytes

 

取荔枝樣品10批次，按照該方法進(jìn)行測定，結(jié)果為HGA含量水平為1.06～3.04 mg/kg，MCPG含量水平為0.26～1.04 mg/kg。對(duì)結(jié)果進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，半成熟荔枝樣品(偏綠)中兩種降糖氨酸成分檢測結(jié)果較高，而完全成熟荔枝樣品(全紅)中兩種降糖氨酸成分檢測結(jié)果較低，說明吃完全成熟荔枝水果可降低兩種降糖氨酸對(duì)體內(nèi)糖代謝的干擾。荔枝樣品和加標(biāo)色譜圖分別見圖6和圖7。

圖6   荔枝樣品分析物的總離子流圖和MRM色譜圖

Fig. 6   Total ion chromatograms and MRM chromatograms of litchi samples

 

圖7   荔枝加標(biāo)樣品分析物的總離子流圖和MRM色譜圖

Fig. 7   Total ion chromatograms and MRM chromatograms of spiked litchi samples

 

3、 結(jié)語

 

利用HPLC-MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)建立了荔枝中HGA和MCPG兩種成分的檢測方法，使用衍生化處理顯著提高了待測物質(zhì)的靈敏度和保留性，通過紅毛丹基質(zhì)標(biāo)曲匹配樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，顯著提高定量測定的準(zhǔn)確性。該方法過程簡便、分析時(shí)間短，測定結(jié)果準(zhǔn)確，適用于荔枝中HGA和MCPG的測定，為“荔枝病”引起的低血糖研究提供有效的檢測手段。

 

 

參考文獻(xiàn)：

 

1 JOHN T J，DAS M，VASHISHTHA V M. Outbreaks of hypoglycemic encephalopathy in Muzzaffarpur，India：Are these caused by toxins in litchi fruit？［J］. Indian Pediatr，2016，53（5）：399.

 

2 PRIYANKA P. A child-killing toxin emerges from shadows：Scientists link mystery deaths in India to consumption of lychees［J］. Science，2015，348：15.

 

3 DAS M，JOHN T J. Lychee-associated acute hypoglycaemic encephalopathy outbreaks in Muzaffarpur，India［J］. Lancet Glob Health，2017，5（9）：e859.

 

4 SHRIVASTAVA A，KUMAR A，THOMAS J D，et al. Association of acute toxic encephalopathy with litchi consumption in an outbreak in Muzaffarpur，India，2014：A case-control study［J］. The Lancet Glob Health，2017，5（4）：e458.

 

5 JOHN T J，DAS M. Acute Encephalitis Syndrome in children in Muzaffarpur：Hypothesis of toxic origin［J］. Curr Sci India，2014，106：1 184.

 

6 劉瑩.小兒荔枝病71例臨床分析［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2000，22（5）：1 038.

    LIU Ying. Clinical research of 71 cases of litchi disease in children［J］. Guangxi Med J，2000，22（5）：1 038.

 

7 許黎忠，林志海，程芳芳，等.荔枝中毒48例急診救治分析［J］.福建醫(yī)藥雜志，2015，37（2）：50.

    XU Lizhong，LIN Zhihai，CHENG Fangfang，et al. Analysis of emergency treatment of 48 cases of litchi poisoning［J］. Fujian Med J，2015，37（2）：50.

 

8 SPENCER P S，PALMER V S. The enigma of litchi toxicity：An emerging health concern in southern Asia［J］. Lancet Glob Health，2017，5（4），383.

 

9 TRIPATHI J，BANDYOPADHYAY N，HAJARE S N，et al. Determination of tolerable dose of litchi fruit considering reported hypoglycin A and MCPG contents through biochemical and histopathological evaluations in mice［J］. Curr Sci India，2019，117（8）：1 292.

 

10 BLAKE O A，BENNINK M R，JACKSON J C. Ackee （Blighia sapida） hypoglycin A toxicity：Dose response assessment in laboratory rats［J］. Food Chem Toxicol，2006，44（2）：207.

 

11 LI D，AGNIHORTI G，DAKOJI S，et al. The toxicity of methylenecyclopropylglcine：Studies of the inhibitory effects of （methylenecyclopropyl）formyl-CoA on enzymes involved in fatty acid metabolism and molecular basis of its inactivation of Enoyl-CoA hydratases［J］. J Am Chem Soc，2002，121（39）：9 034.

 

12 ISENBERG S L，CARTER M D，GRAHAM L A，et al. Quantification of metabolites for assessing human exposure to soapberry toxins hypoglycin a and methylenecyclopropylglycine［J］. Chem Res Toxicol，2015，28（9）：1 753.

 

13 張鐘，黃麗花，張玲，等.荔枝肉水溶性多糖降血糖作用［J］.食品科學(xué)，2013，34（15）：303.

    ZHANG Zhong，HUANG Lihua，Zhang Ling，et al. Hypoglycemic effect of water-soluble polysaccharides from litchi flesh［J］. Food Science，2013，34（15）：303.

 

14 ISENBERG S L，CARTER M D，HAYER S R，et al. Quantification of toxins in soapberry （Sapindaceae） Arils：Hypoglycin A and methylenecyclopropylglycine［J］. J Agric Food Chem，2016，64（27）：5 607.

 

15 YANG J L，ZHU X G，ZHANG P，et al. Detection of toxic methylenecyclopropylglycine and hypoglycin A in litchi aril of three Chinese cultivars［J］. Food Chem，2020，327：1.

 

16 SANFORD A A，ISENBERG S L，CARTER M D，et al. Quantitative HPLC-MS/MS analysis of toxins in soapberry seeds：Methylenecyclopropylglycine and hypoglycin A［J］. Food Chem，2018，264：449.

 

17 SANFORD A A，ISENBERG S L，CARTER M D，et al. Quantification of hypoglycin A and methylenecyclopropylglycine in human plasma by HPLC-MS/MS. J Chromatography B，2018，1 095：112.