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蛋白質(zhì)免疫印跡法是基于蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳分離和特異性抗體識(shí)別蛋白的特性，通過(guò)顯色技術(shù)，以達(dá)到檢測(cè)目的蛋白的技術(shù)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于定性檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)，活性分析與鑒定。

 

該實(shí)驗(yàn)步驟多，關(guān)鍵點(diǎn)多，耗時(shí)長(zhǎng)，每個(gè)步驟可能都影響最終的結(jié)果，所以實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常出現(xiàn)各種問(wèn)題。筆者根據(jù)個(gè)人實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中遇到的問(wèn)題將從WB的配膠和電泳階段分析問(wèn)題原因或給出解決方法。

 

一、配膠階段注意事項(xiàng)

 

配膠試劑管理：

應(yīng)確保所使用的配膠試劑在有效期內(nèi)，且試劑需清澈透明。若發(fā)現(xiàn)有沉淀或結(jié)晶產(chǎn)生，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行更換。

 

2. pH 8.8的Tris-HCl和pH 6.8的Tris-HCl可能會(huì)出現(xiàn)沉淀，因此需根據(jù)需要選擇合適的濃度（1.0M或1.5M）。同時(shí)，10%的SDS在低溫（4℃以下）存放時(shí)容易結(jié)晶，而30%的丙烯酰胺則需要在避光且低溫（4℃以下）的條件下保存。

APS（過(guò)硫酸銨）活性較強(qiáng)，室溫下容易失效，建議進(jìn)行分裝后冷凍保存于-20℃。由于TEMED（四甲基乙二胺）揮發(fā)性強(qiáng)且有毒，因此需要在通風(fēng)條件良好的環(huán)境下使用，避免長(zhǎng)時(shí)間直接暴露在空氣中。

 

操作技巧：

1. 在插入梳子時(shí)，應(yīng)采用斜插的方式，以有效避免氣泡的產(chǎn)生。

2. 為了防止膠條老化和干燥，電泳結(jié)束后，應(yīng)將膠條置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上晾干。如果膠條出現(xiàn)裂紋，可以使用保鮮膜進(jìn)行覆蓋，這樣不僅可以防止膠液泄漏，還能延緩膠條的老化。

3. 最佳的操作方法是現(xiàn)配現(xiàn)用膠。如果需要保存，可以使用濕潤(rùn)的保鮮膜將膠包好，并放置在4℃的冰箱中。

 

常見(jiàn)問(wèn)題分析：

1.漏膠問(wèn)題：

原因分析：漏膠通常由于玻璃板未對(duì)齊、底部缺損、厚玻璃板邊條密閉性不佳或塑料夾子過(guò)松所導(dǎo)致。

解決方法：在操作前，務(wù)必確保玻璃板干燥，以防潮濕影響對(duì)齊。在對(duì)齊玻璃板時(shí)，應(yīng)使用一手的食指按壓厚玻璃板的一側(cè)上緣，同時(shí)用拇指按壓薄玻璃板的同側(cè)上緣，然后同時(shí)向下按壓并鎖定該側(cè)的鎖扣。接著，重復(fù)此步驟以鎖定另一側(cè)，確保玻璃板緊密對(duì)齊。

 

2.膠體未凝固：

原因分析：膠體未能凝固可能是由于APS或TEMED失效，或者在膠體未完全凝固時(shí)對(duì)其進(jìn)行了移動(dòng)。

解決方法：在制備膠體前，確認(rèn)所有試劑的有效性，并嚴(yán)格按照正確的配比進(jìn)行混合。如果配比無(wú)誤但膠體仍未凝固，可以嘗試增加凝固劑的用量或延長(zhǎng)凝固時(shí)間。

 

3.膠體中存在氣泡：

情況一：膠底部出現(xiàn)氣泡，可能是膠墊材質(zhì)或梳子插入不當(dāng)所致?？筛挠脤?shí)心軟膠墊或添加保鮮膜。

情況二：梳子下緣出現(xiàn)氣泡，解決方法是先插入一側(cè)梳子再插另一側(cè)。

 

4.拔梳子后泳道有膠絲：

原因分析：此問(wèn)題通常是由于TEMED用量過(guò)多，導(dǎo)致膠體凝固過(guò)快。

解決方法：在制備膠體時(shí)，適當(dāng)減少TEMED的用量。

 

5.拔梳子后泳道歪斜：

原因分析：泳道歪斜往往是由于梳子與玻璃板不匹配所致。

解決方法：在灌膠之前，務(wù)必先測(cè)試梳子與玻璃板的匹配度，確保它們能夠緊密貼合。

 

二、電泳階段注意事項(xiàng)

 

電泳操作要點(diǎn)：

1.確保上樣一致性：

在進(jìn)行上樣時(shí)，必須確保每個(gè)加樣孔的上樣體積保持一致，這樣可以避免蛋白條帶出現(xiàn)水平不齊的情況。對(duì)于空置的加樣孔，需要添加與樣品等體積的1×loading buffer，以防止相鄰?fù)ǖ赖牡鞍讟悠钒l(fā)生擴(kuò)散。同時(shí)，上樣時(shí)應(yīng)緩慢添加樣品，避免快速吹打?qū)е聵悠芬绯?，且上樣體積應(yīng)控制在加樣孔總?cè)莘e之內(nèi)。

 

2.電泳液的使用：

內(nèi)槽需要被電泳液填滿，而外槽則只需填至1/4處。對(duì)于不同厚度的玻璃板，上樣量也有所不同。例如，1.0mm厚的玻璃板每孔最多可以上樣20μL，而1.5mm厚的玻璃板每孔則可以上樣40μL。

 

3.合理設(shè)置電壓：

電壓的設(shè)置需要根據(jù)環(huán)境溫度來(lái)調(diào)整。在夏季室溫較高時(shí)，應(yīng)適當(dāng)降低電壓；而在冬季則可以提高電壓。分離膠的固定電壓應(yīng)設(shè)為150V。在調(diào)節(jié)電壓時(shí)間時(shí)，可以參考marker的位置。當(dāng)marker分開(kāi)時(shí)，表示蛋白已經(jīng)進(jìn)入分離膠。此外，在夏季高溫時(shí)，可以將電泳槽放入冰水中進(jìn)行降溫，以防止凝膠發(fā)生變形。

4.常見(jiàn)問(wèn)題分析：

 

1）電泳帶扭曲或歪斜：

原因分析：這種情況通常是由于電泳液未加足夠或發(fā)生漏液所導(dǎo)致。

解決方法：在電泳過(guò)程中，要及時(shí)檢查和補(bǔ)充電泳液，以確保電泳槽內(nèi)的液體保持足夠的量，從而逐漸糾正電泳帶的走向。

 

2）電泳帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象：

原因分析：拖尾現(xiàn)象往往是因?yàn)闃颖疚茨艹浞秩芙狻?/span>

解決方法：在進(jìn)行上樣前，務(wù)必確保樣本已經(jīng)完全溶解，這樣可以有效減少拖尾現(xiàn)象的發(fā)生。

 

3）電泳帶向兩側(cè)過(guò)度擴(kuò)散：

原因分析：擴(kuò)散過(guò)度通常是由于上樣量過(guò)多所引起。

解決方法：應(yīng)當(dāng)適當(dāng)減少上樣量，以控制電泳帶的擴(kuò)散范圍，保持電泳帶的清晰度。

 

4）溴酚藍(lán)呈笑臉狀：

原因分析：當(dāng)制膠試劑溫度過(guò)高或制膠后未能及時(shí)保濕時(shí)，可能導(dǎo)致膠層不均勻，從而使得溴酚藍(lán)呈現(xiàn)特殊的笑臉形狀。

解決方法：在進(jìn)行電泳時(shí)，應(yīng)降低電壓并調(diào)節(jié)電泳速度，同時(shí)確保電泳過(guò)程在冰浴條件下進(jìn)行，以減少膠層不均勻的情況。

 

5）電泳條帶不整齊：

原因分析：條帶不整齊可能由于膠凝固不均勻、膠的下邊緣存在氣泡、上樣buffer濃度不準(zhǔn)確或在拔梳子時(shí)操作不當(dāng)所導(dǎo)致。

解決方法：應(yīng)等待膠完全凝固后再進(jìn)行上樣，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最佳性；電泳前需仔細(xì)檢查并清除膠底部的氣泡；重新配置適宜濃度的上樣buffer；在拔梳子時(shí)，應(yīng)水平且緩慢地進(jìn)行，以確保樣品孔的均勻性。

 

6）電泳條帶過(guò)粗：

原因分析：條帶過(guò)粗可能是由于上樣量過(guò)大、濃縮膠未能有效濃縮、濃縮膠的pH值不準(zhǔn)確或電壓過(guò)高所導(dǎo)致。

解決方法：應(yīng)適量減少上樣量；考慮增加濃縮膠的長(zhǎng)度以提高濃縮效果；確保濃縮膠的pH值調(diào)整至正確的6.8；同時(shí)，適當(dāng)降低電泳的電壓。

 

通過(guò)嚴(yán)格遵守上述電泳階段的注意事項(xiàng)，并不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程，可以有效提升Western Blot實(shí)驗(yàn)的成功率，并確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。