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內(nèi)容提要：遺傳毒性檢驗(yàn)是醫(yī)療器械檢驗(yàn)中保證安全性的重要組成部分。GB/T 16883.3-2019 新版本的發(fā)布，對(duì)醫(yī)療器械的遺傳毒性檢測提出了更具體的要求。并且隨著YY/T 0870 一系列行標(biāo)的更新，對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容也進(jìn)行了調(diào)整。本文將著重介紹標(biāo)準(zhǔn)更新后對(duì)于醫(yī)療器械遺傳毒性檢驗(yàn)的影響，以期為醫(yī)療器械產(chǎn)品具體的遺傳毒性檢測提供參考。

關(guān) 鍵 詞：醫(yī)療器械 遺傳毒性 標(biāo)準(zhǔn)更新

醫(yī)療器械和材料的安全性評(píng)價(jià)是其質(zhì)量評(píng)價(jià)中重要組成部分，也是保證產(chǎn)品或材料安全使用的基礎(chǔ)。而生物相容性評(píng)價(jià)作為安全性評(píng)價(jià)的一部分，通過系列體內(nèi)或體外試驗(yàn)方法，綜合評(píng)價(jià)醫(yī)療器械和材料對(duì)生物體可能的有害作用，以保證臨床使用時(shí)的安全性。生物相容性評(píng)價(jià)通常由一系列試驗(yàn)組合而成，如細(xì)胞毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)、刺激試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)、全身毒性試驗(yàn)等。其中醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn)旨在評(píng)價(jià)人體接觸醫(yī)療器械或生物材料的潛在遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)，了解器械或材料是否具有細(xì)胞誘變、基因突變和潛在致癌性等，對(duì)于保證醫(yī)療器械安全具有重大意義[1]。GB/T 16886.3《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第3 部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)》[2] 中介紹了關(guān)于醫(yī)療器械遺傳毒性、致癌性和生殖毒性的一些試驗(yàn)方法及相關(guān)要求。隨著醫(yī)療器械行業(yè)的迅速發(fā)展，產(chǎn)品的遺傳毒性檢測也遇到了越來越多的挑戰(zhàn)，也提出了更高的要求。為更科學(xué)可靠地對(duì)醫(yī)療器械產(chǎn)品進(jìn)行檢測，2019 年GB/T 16886.3 進(jìn)行了更新，更新后的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)遺傳毒性試驗(yàn)要求也有相應(yīng)調(diào)整。為更好地與更新后的國標(biāo)相適應(yīng)，遺傳毒性試驗(yàn)也有一些行標(biāo)陸續(xù)發(fā)布與更新，這些標(biāo)準(zhǔn)對(duì)細(xì)化的試驗(yàn)方法也進(jìn)行了一些更改。本文將對(duì)遺傳毒性試驗(yàn)新舊版本標(biāo)準(zhǔn)的變化進(jìn)行概述，希望可以對(duì)醫(yī)療器械遺傳毒性檢測方案設(shè)計(jì)、試驗(yàn)選擇以及試驗(yàn)實(shí)施等提供參考。

1.遺傳毒性簡介以及發(fā)布的國行標(biāo)

醫(yī)療器械遺傳毒理學(xué)是現(xiàn)代遺傳學(xué)和毒理學(xué)的一個(gè)共同分支，也是研究醫(yī)療器械/ 材料或其浸提液等物理、化學(xué)和生物因素對(duì)有人體遺傳作用的一門科學(xué)。遺傳毒性試驗(yàn)主要通過原發(fā)性遺傳學(xué)終點(diǎn)或?qū)е履骋唤K點(diǎn)的DNA損傷的檢測過程以及其結(jié)果，來確定醫(yī)療器械/ 材料或其浸提液等物理、化學(xué)和生物因素產(chǎn)生遺傳物質(zhì)損傷并導(dǎo)致遺傳性改變的能力[3]。遺傳毒性試驗(yàn)利用哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母菌、真菌或整體動(dòng)物測定試驗(yàn)樣品是否會(huì)引起基因突變、染色體結(jié)構(gòu)畸變以及其他DNA或基因變化。通過一系列試驗(yàn)組合可以對(duì)受試物是否有遺傳毒性進(jìn)行預(yù)測，也對(duì)受試物的潛在致癌性進(jìn)行初步的評(píng)估，保障醫(yī)療器械的安全性，降低危害風(fēng)險(xiǎn)。遺傳毒性試驗(yàn)方法眾多，根據(jù)試驗(yàn)系統(tǒng)不同可分為體外和體內(nèi)試驗(yàn)；根據(jù)檢測方法針對(duì)與腫瘤相關(guān)的遺傳學(xué)終點(diǎn)，可大致分為三大類，即基因突變、染色體損傷和DNA斷裂[4]。雖然在經(jīng)典的毒理學(xué)試驗(yàn)中，在單項(xiàng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中即可觀察到幾個(gè)相關(guān)參數(shù)或終點(diǎn)，但在遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)中卻難以做到。目前沒有一種試驗(yàn)可以同時(shí)具有染色體損傷、基因突變及DNA損傷等不同類別的遺傳學(xué)終點(diǎn)，為科學(xué)全面地評(píng)價(jià)產(chǎn)品或材料潛在的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)，一般采用具有不同遺傳學(xué)終點(diǎn)的組合實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行評(píng)價(jià)。

而遺傳毒性試驗(yàn)按照其反映的遺傳學(xué)終點(diǎn)共分為三類：即檢測基因突變、染色體損傷與DNA斷裂。不同檢測終點(diǎn)應(yīng)用于醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn)方法總結(jié)如下：①檢測基因突變：細(xì)菌回復(fù)性突變?cè)囼?yàn)（YY/T 0870.1/OECD 471）、體外哺乳動(dòng)物基因突變?cè)囼?yàn)（HPRT或TK）（YY/T 0870.3/OECD 476）；②染色體損傷：哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)（YY/T 0870.4/OECD 474）、體內(nèi)哺乳動(dòng)物染色體畸變?cè)囼?yàn)（YY/T 0870.5/OECD 475）、體外哺乳動(dòng)物染色體畸變?cè)囼?yàn)（YY/T 0870.2/OECD 473）、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)（YY/T 0870.6/OECD 487）；③DNA損傷斷裂：體內(nèi)彗星試驗(yàn)（YY/T 0870.7/OECD 489）、體外彗星試驗(yàn)、體內(nèi)哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞非程序性DNA合成試驗(yàn)（OECD 486）、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞姊妹染色單體互換試驗(yàn)（OECD 479）。這些試驗(yàn)部分我國已經(jīng)分布了相對(duì)應(yīng)的推薦性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，部分試驗(yàn)其標(biāo)準(zhǔn)仍在制定討論中。

目前，我國針對(duì)遺傳毒性試驗(yàn)發(fā)布并實(shí)施了以下國行標(biāo)：GB/T 16886.3-2019《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第3 部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)》、YY/T 0870.1-2013《醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn) 第1 部分：細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》、YY/T 0870.2-2019《醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn) 第2 部分：體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)》、YY/T 0870.3-2019《醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn) 第3 部分：用小鼠淋巴瘤細(xì)胞進(jìn)行TK基因突變?cè)囼?yàn)》、YY/T 0870.4-2014《醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn) 第4 部分：哺乳動(dòng)物骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)》、YY/T 0870.5-2014《醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn) 第5 部分：哺乳動(dòng)物骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)》、YY/T 0870.6-2019《醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn) 第6 部分：體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)》、YY/T 0870.7《醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn) 第7 部分：哺乳動(dòng)物體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)》。

2.GB/T 16886.3-2019國標(biāo)更新變化

2.1 實(shí)驗(yàn)組合選擇原則變化

與GB/T 16886.3-2008相比，新版GB/T 16886.3-2019進(jìn)一步明確了評(píng)價(jià)策略。標(biāo)準(zhǔn)的遺傳毒性試驗(yàn)組合由原標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的細(xì)菌回復(fù)性突變、L5178Y小鼠淋巴瘤TK基因正向突變?cè)囼?yàn)與染色體畸變?cè)囼?yàn)三項(xiàng)（或是細(xì)菌回復(fù)性突變與L5178Y小鼠淋巴瘤TK基因正向突變?cè)囼?yàn)兩項(xiàng)）調(diào)整為染色體畸變?cè)囼?yàn)和L5178Y小鼠淋巴瘤TK基因正向突變?cè)囼?yàn)中任意一個(gè)與細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)組合。調(diào)整后的組合更為簡單明確，節(jié)約檢測成本。該標(biāo)準(zhǔn)組合既涵蓋了不同進(jìn)化程度的物種（包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞）也包含了不同遺傳學(xué)檢測終點(diǎn)（基因突變和染色體畸變）。若按標(biāo)準(zhǔn)選擇的兩個(gè)體外遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果為陰性，則無需進(jìn)行進(jìn)一步的動(dòng)物體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)。如果任一體外遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果為陽性，應(yīng)該考慮：①相同檢測終點(diǎn)的其他試驗(yàn)?zāi)芊裼^察到這種結(jié)果；②體外作用方式或作用機(jī)制是否與人體相關(guān)；③更重要的是在體內(nèi)預(yù)期暴露量下，能否觀察到該陽性結(jié)果。參照GB/T16886.3-2019，宜使用下列階梯式流程評(píng)估是否追加體內(nèi)試驗(yàn)（圖1）。

2.2 增加樣品在遺傳毒性試驗(yàn)中制備的程序指南

在GB/T 16886.3-2019 中，附錄A增加了樣品在開展遺傳毒性試驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮的因素以及合適的制備程序。對(duì)于聚合物、無機(jī)材料等成分組成的樣品，應(yīng)當(dāng)充分考慮具有潛在遺傳風(fēng)險(xiǎn)的物質(zhì)，例如低分子量化學(xué)物、金屬離子等。這些成分可能會(huì)在產(chǎn)品使用中遷移并進(jìn)入患者體內(nèi)從而引發(fā)健康風(fēng)險(xiǎn)。低分子量化學(xué)物可透過細(xì)胞膜與基因、DNA或染色體發(fā)生反應(yīng)從而產(chǎn)生遺傳毒性。器械材料中部分少量的添加劑、催化劑以及交聯(lián)劑就是低分子量化學(xué)物。在評(píng)價(jià)這些材料時(shí)，應(yīng)該結(jié)合添加的具體的低分子量化學(xué)物或者金屬離子文獻(xiàn)資料來選擇合適的樣品制備方式。此外，如今醫(yī)療器械研發(fā)創(chuàng)新水平不斷加強(qiáng)，越來越多的新型醫(yī)療器械進(jìn)入人們視野?？山到獠牧?、納米材料、添加生物活性因子的材料被廣泛投入器械研發(fā)中。這些新型材料和傳統(tǒng)材料不同，由于其具有特殊的理化性質(zhì)，部分可能有潛在的活性或毒性，選擇合適的樣品制備方法對(duì)最終的遺傳毒性結(jié)果至關(guān)重要。因此在樣品制備時(shí)應(yīng)結(jié)合具體的材料類型、特性以及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)選擇合適的浸提介質(zhì)以及浸提方式。

3.系列行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)更新

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0870.1-2013《醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn) 第1 部分：細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》[5] 目前還沒有變化，試驗(yàn)方法沒有調(diào)整。體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0870.2 由2019 版本代替了2013 版本[6]。新版本下的體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)主要有以下幾方面的變化：①加入中期阻斷劑時(shí)間由2~4h 調(diào)整為1~3h；②結(jié)果觀察的中期分裂相由200個(gè)調(diào)整為300個(gè)；③新版明確規(guī)定了試驗(yàn)設(shè)立短期接觸組和長期接觸組，2013 版本沒有明確此要求；④新版增加了實(shí)驗(yàn)室能力以及歷史對(duì)照數(shù)據(jù)要求，對(duì)于質(zhì)量管理要求增加；⑤明確了預(yù)試驗(yàn)細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法。綜上，體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)行標(biāo)的更新細(xì)化了試驗(yàn)細(xì)節(jié)，統(tǒng)一且明確了操作方法，對(duì)于結(jié)果的觀察以及評(píng)定更加嚴(yán)謹(jǐn)以及嚴(yán)格，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室的能力以及歷史數(shù)據(jù)提出了更高的要求。這些改變更有利于得到穩(wěn)定、科學(xué)且可控的試驗(yàn)結(jié)果。同樣，小鼠淋巴瘤TK基因突變?cè)囼?yàn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0870.3也由2019版本代替了2013版本[7]。新的版本也有如下幾點(diǎn)不同于2013 版本：①細(xì)胞株平均自發(fā)突變頻率由（35~140）×10-6 范圍調(diào)整為（50~170）×10-6；②增加了陽性對(duì)照試劑種類；③詳細(xì)地明確了預(yù)試驗(yàn)操作步驟；④制備好的平板培養(yǎng)時(shí)間由11~14d改為10~12d；⑤數(shù)據(jù)處理處增加了相對(duì)懸浮生長率和相對(duì)總生長，刪除了小集落突變率；⑥陰性及陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)略有調(diào)整，且增加了歷史對(duì)照數(shù)據(jù)以及實(shí)驗(yàn)室能力要求。小鼠淋巴瘤TK基因突變?cè)囼?yàn)根據(jù)該試驗(yàn)背景數(shù)據(jù)的不斷增多而調(diào)整了其試驗(yàn)細(xì)節(jié)以及判斷標(biāo)準(zhǔn)，豐富了陽性劑種類給予了實(shí)驗(yàn)者更多選擇的空間。目前，YY/T 0870.4[8]、YY/T 0870.5[9]、YY/T 0870.6[10]尚未有新版標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，仍用2014 年（YY/T 0870.4、YY/T 0870.5）或2019 年（YY/T 0870.6）版本。而近一年來，YY/T 0870.7 和YY/T 0870.8 也陸續(xù)發(fā)布與征求意見，也使得醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn)更系統(tǒng)與全面，增大了選擇空間，規(guī)范了試驗(yàn)細(xì)節(jié)。YY/T 0870.7-2023《醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn) 第7部分：哺乳動(dòng)物體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)》[11] 于2023 年1 月13 日正式發(fā)布，于2024 年1 月15 日正式實(shí)施。這一標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布，對(duì)體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)操作有了更細(xì)致的指導(dǎo)與更明確的要求。該試驗(yàn)通過測定動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂來判斷材料是否具有潛在的遺傳毒性。利用檢測材料導(dǎo)致細(xì)胞中DNA斷裂情況來了解其致突變性。試驗(yàn)選擇大鼠開展，通過動(dòng)物與樣品接觸后取動(dòng)物組織，若沒有明確靶組織的情況下選擇肝臟制備樣本，電泳染色后通過熒光顯微鏡對(duì)150 個(gè)可評(píng)分細(xì)胞進(jìn)行尾部DNA百分比分析。作為檢驗(yàn)DNA損傷斷裂的重要試驗(yàn)方法，體內(nèi)彗星試驗(yàn)十分敏感且試驗(yàn)周期較短。它可用來初步判斷外來物是否具有致癌致畸性，并衡量對(duì)人體內(nèi)DNA的影響程度。如果檢測物質(zhì)具有DNA破壞性，被破壞的DNA將游離細(xì)胞核，形成彗星形狀[12]。隨著檢測物毒性的加大，受損傷的DNA增多，DNA碎片增多，越小的DNA碎片游離得越快，因此，彗星尾部越長，待測物毒性越強(qiáng)。此外，同時(shí)檢測DNA損傷終點(diǎn)的體內(nèi)哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞程序外DNA合成試驗(yàn)也發(fā)布了標(biāo)準(zhǔn)的征求意見稿，正在征求意見階段。YY/T 0870.8《醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn) 第8 部分：體內(nèi)哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞程序外DNA合成試驗(yàn)》已在2023 年征求意見，預(yù)計(jì)2024 年發(fā)布。與YY/T 0870.7 類似，該試驗(yàn)也是通過測定大鼠體內(nèi)DNA損傷來判斷檢測物質(zhì)致突變性。

4.小結(jié)

遺傳毒性試驗(yàn)通過一系列組合性試驗(yàn)的結(jié)合，檢測醫(yī)療器械的致突變性，是器械安全性評(píng)價(jià)的重要組成部分，與醫(yī)療器械的質(zhì)量安全密不可分。經(jīng)過不斷地發(fā)展與臨床使用的檢驗(yàn)，醫(yī)療器械的遺傳毒性評(píng)價(jià)也越來越完善，越來越成熟，越來越系統(tǒng)化。而標(biāo)準(zhǔn)的更新也體現(xiàn)出在當(dāng)今醫(yī)療器械研發(fā)情況下，對(duì)該類項(xiàng)目評(píng)價(jià)新的思考與要求。GB/T 16886.3 以及YY/T 0870系列標(biāo)準(zhǔn)給出了用于檢測醫(yī)療器械遺傳毒性的試驗(yàn)方法以及試驗(yàn)的選擇策略，以及不同情況下危險(xiǎn)（源）如何識(shí)別。危害的識(shí)別是復(fù)雜的，在適當(dāng)情況下，達(dá)到最大試驗(yàn)靈敏度非常重要。標(biāo)準(zhǔn)的更新變化很大程度上也傳達(dá)了一個(gè)理念，即不必硬性地按照所介紹的試驗(yàn)方法或所規(guī)定的試驗(yàn)程序進(jìn)行評(píng)價(jià)，研究者應(yīng)根據(jù)所研究的醫(yī)療器械或材料的具體情況、實(shí)際應(yīng)用方式、已報(bào)道的可靠的背景數(shù)據(jù)以及不斷積累的臨床經(jīng)驗(yàn)來進(jìn)行研究與分析，選擇適宜的試驗(yàn)方法，確定合適的檢測指標(biāo)，制定適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)程序，最終對(duì)結(jié)果進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)定[13]。此外，標(biāo)準(zhǔn)中增加對(duì)歷史對(duì)照數(shù)據(jù)以及實(shí)驗(yàn)室能力的要求，包括部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察樣本量的增加也體現(xiàn)了對(duì)于遺傳毒性評(píng)價(jià)更加嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)的態(tài)度以及需要更綜合的分析[14]。