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單分子測序（Single-molecule Sequencing，SMS）是在第一代Sanger測序、第二代NGS高通量測序技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第三代測序技術(shù)。因其測序時DNA分子無需PCR擴增，實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨測序而得名。Helico Bioscices公司基于合成測序理論于2008年推出了世界上第一款單分子測序平臺HeliScope，但其測序的平均讀長相對較短，系統(tǒng)整體測序錯誤率較高[1]。之后出現(xiàn)了單分子的長讀長測序技術(shù)，目前已經(jīng)實現(xiàn)商業(yè)化的長讀長測序技術(shù)主要有Pacific Biosciences（PacBio）公司的單分子實時測序技術(shù)（Single-molecule Real-time，SMRT）和Oxford Nanopore公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）的納米孔測序技術(shù)[2]。SMS和SMRT技術(shù)主要是將４種不同的堿基轉(zhuǎn)化為熒光信號，然后通過轉(zhuǎn)化放大后的信號對堿基進行區(qū)分。而納米孔測序技術(shù)則是將４種堿基轉(zhuǎn)換為電信號，然后對電信號進行收集、整理、轉(zhuǎn)化與數(shù)據(jù)輸出，與單分子熒光測序技術(shù)在信號處理上存在較大差異，故而納米孔測序技術(shù)也被稱為第四代測序技術(shù)。本文將主要介紹納米孔單分子測序技術(shù)的原理、特點及其在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。

 

一、納米孔測序的原理

 

納米孔單分子測序技術(shù)是基于電信號測序的技術(shù)，相對于其他測序技術(shù)， 納米孔測序技術(shù)的樣本處理極其簡單，無需DNA聚合酶或者連接酶，也無需dNTPs，其測序過程中包含了以下幾種關(guān)鍵物質(zhì)，如圖1、圖2所示。

 

納米孔蛋白（Nanopore），可以嵌入到細胞膜中作為離子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白納米孔。

 

多聚物薄膜（Membrane），跨膜蛋白會被嵌入到高電阻率的由人工合成的多聚物膜中，膜兩側(cè)是離子溶液，在兩側(cè)加不同的電位，離子就會在孔中流動，形成電流。

 

馬達蛋白（Motor protein），在納米孔測序文庫構(gòu)建時，需要在接頭上連接一種馬達蛋白，用于將DNA或RNA分子推入納米孔中。

 

連接臂（Tether），用于錨定DNA或RNA鏈，防止其在溶液中飄動，并使其進入納米孔中。

 

將人工合成的多聚物膜浸沒在離子溶液中，膜上布滿了由解旋酶和蛋白孔兩部分組成的跨膜通道蛋白納米孔，在膜兩側(cè)施加不同電壓形成電壓差。由于多聚物膜不可導電，電流只能通過納米孔進行傳導。連接臂引導待測鏈進入納米孔，待測鏈在馬達蛋白的牽引下經(jīng)解螺旋后以單鏈形式穿過納米孔（如圖1）。不同堿基在通過納米孔的恒定的電場時會引起電流不同幅度的變化，使用計算機軟件及人工智能算法識別并推斷出堿基類型，從而完成了DNA或RNA的測序[3]（如圖2）。

 

二、納米孔的類型

 

1.生物納米孔

 

納米孔測序的概念首次在80年代被提出，并且隨著納米孔蛋白及馬達蛋白的技術(shù)發(fā)展而得以實現(xiàn)。第一個被發(fā)現(xiàn)可以通過DNA或RNA影響離子電流并能使之被檢測到的納米孔蛋白是1996年Kasianowicz等提出的α-溶血素蛋白[4]。但是因DNA通過納米孔的速率過快，而無法獲得有效的電流信號。之后的2010年，恥垢分枝桿菌蛋白A（Msp-A）納米孔被發(fā)現(xiàn)可以減緩DNA穿過納米孔的速度，提高DNA單堿基的檢測靈敏度[5]。隨后，2014年研究者發(fā)現(xiàn)使用phi29 DNA聚合酶作為馬達蛋白[6]，可以控制DNA穿過納米孔的速度。

 

生物納米孔主要包含以上3種，均為由某種蛋白質(zhì)分子鑲嵌在磷脂膜上形成的天然納米孔，可以進行靈活的生物化學修飾。然而生物納米孔在膜穩(wěn)定性、 電流噪聲等方面的問題在一定程度上限制了其發(fā)展。牛津納米孔公司在蛋白納米孔的應(yīng)用方面取得了一定進展， 他們的GridION和MinION系統(tǒng)就是基于生物蛋白納米孔的測序平臺。 

 

2.  固態(tài)納米孔

 

Li等在2001年開啟了固態(tài)納米孔的研究[7]。固態(tài)納米孔主要是在氧化硅、石墨烯等固態(tài)材質(zhì)上通過離子束刻蝕等技術(shù)制備出的納米孔，因其尺寸可調(diào)、可靠性高、易修改等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于DNA測序、蛋白質(zhì)檢測和能量轉(zhuǎn)換等研究領(lǐng)域[8]，其中比較常見用于DNA檢測的固態(tài)納米孔是氮化硅納米孔和石墨烯納米孔。

 

相比于生物納米孔，固態(tài)納米孔在穩(wěn)定性、電流噪聲、工藝集成方面有著顯著的優(yōu)勢，但是因為受限于如今的半導體工藝制造水平，固態(tài)納米孔的制造還較為復雜與昂貴。

 

三、納米孔測序的特點

 

相比于其他測序平臺，納米孔測序作為一種新型測序技術(shù)在成本、速度、讀長和準確率等諸多方面有著不同的特點，其優(yōu)勢十分顯著，主要可以概括為以下幾點：

 

1.較長的測序讀長

 

納米孔測序技術(shù)利用堿基穿過納米孔時電信號的改變實現(xiàn)測序，理論上可檢測通過納米孔的全部核酸序列，讀長長度僅受限于所測單鏈DNA的長度[9]。長度長可以提供更完整、更連續(xù)的基因組組裝，在具有大型結(jié)構(gòu)變異和高水平重復區(qū)域的基因組中優(yōu)勢顯著。

 

2.可快速實時測序

 

相比于其他傳統(tǒng)測序，納米孔測序真正意義上做到了動態(tài)實時測序，可邊測序邊輸出結(jié)果，用戶可以在測序早期了解樣本的質(zhì)量和狀態(tài)，也可以在獲得足夠的數(shù)據(jù)后停止測序。同時納米孔測序技術(shù)所需的時長也是遠遠短于其他測序方法，節(jié)約了操作時間同時降低了測序成本。

 

3.納米孔測序設(shè)備簡單便攜

 

目前使用最成熟的MinION測序儀尺寸只有一支筆的長度，重量大約100g，長度僅10cm，可使用高速USB插入電腦，以其極小的體積徹底顛覆了人們對測序儀的印象，被稱為“Ｕ盤測序儀”[10]。因其便攜性，可在實驗室、野外甚至太空等各種復雜環(huán)境下完成實時測序，可保證對突發(fā)疫情處理的時效性。 

 

4.可直接對RNA進行測序

 

納米孔測序可以直接對各類原始DNA和RNA進行測序，不僅節(jié)省了時間和成本，完整地保留堿基修飾的信息，還能避免將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA擴增所產(chǎn)生的偏向性及可能引入的突變。其文庫制備的工作流程也較為簡單。

 

雖然納米孔測序的優(yōu)點十分明顯，與前幾代技術(shù)相比在成本、速度方面有著很大優(yōu)勢，但是目前還處在起步階段，從測序原理到制造工藝都存在有許多問題。首先，檢測準確度相對較低，這是納米孔測序發(fā)展過程中一直致力于解決的問題，除了通過優(yōu)化納米孔和馬達蛋白外，還通過獨立研究開發(fā)的算法來解決準確度的問題。其次，檢測通量和文庫產(chǎn)量也限制了該技術(shù)的應(yīng)用。目前仍然缺乏針對少量樣品的高產(chǎn)量文庫制備和測序規(guī)范流程。而且也并非總是能夠從臨床樣本中獲得足夠大且完整的高分子量DNA和全長RNA。讀取長度和產(chǎn)量之間仍需權(quán)衡。

 

四、納米孔測序的應(yīng)用

 

納米孔測序有獨特的優(yōu)勢：長度長，測序速度快，這讓它在某些場景中占有很大的優(yōu)勢，但是通量偏低、價格高、準確度偏低也嚴重限制了它的應(yīng)用場景。根據(jù)之前的分析，對讀長要求高，但是對序列數(shù)和準確度要求不高的應(yīng)用場景才是納米孔測序的最適場景。

 

1.大基因組拼接

 

在以往基于短片段的基因組拼接中，由于一些動植物基因組本身具有多倍體，高度重復，高度雜合的特性，導致基因組拼接異常艱難。而納米孔測序技術(shù)具有長讀長的特點，利于大基因組的拼接，可以極大的提高基因組的完整性。

 

2.全長轉(zhuǎn)錄組

 

以往的轉(zhuǎn)錄組分析由于無法直接對RNA進行測序，往往需要先對mRNA進行打斷，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA，無法獲取和分析全長轉(zhuǎn)錄本。納米孔的長讀長特點可以準確識別各基因的多個同源異構(gòu)體，簡單準確；并且可以直接測序RNA，直接識別RNA的堿基修飾。

 

3.大片段結(jié)構(gòu)變異

 

基因組上會產(chǎn)生很多與人類疾病相關(guān)的大片段結(jié)構(gòu)變異（如缺失、倒位和易位等），短測序讀長無法準確檢測這些變異，而納米孔測序的讀長較長，適合進行大片段結(jié)構(gòu)變異的檢測，在疾病研究等方面具有良好的發(fā)展前景。

 

4.病原微生物快速鑒定[11]

 

由于納米孔測序具有實時，快速的特點，可以在采集點直接進行測序，實時得到序列信息進行物種分類鑒定，完成病原微生物的快速鑒定。目前納米孔測序技術(shù)在傳染病、臨床感染病原快速檢測中的應(yīng)用研究較為廣泛。

 

五、結(jié)論與展望

 

納米孔測序技術(shù)近年來發(fā)展迅猛，相比于其他測序技術(shù)，其憑借著超長讀長、實時監(jiān)測、簡單便攜等特點開始被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，但是目前納米孔測序技術(shù)也不盡完美。目前國內(nèi)外多家企業(yè)在研發(fā)準備申報相關(guān)單分子測序產(chǎn)品的過程中，主要集中在病原體檢測和腫瘤、遺傳病早篩等方向，后續(xù)我們會繼續(xù)關(guān)注相關(guān)產(chǎn)品的準確度、檢測通量及文庫制備的相關(guān)技術(shù)進展。

 

參考文獻：

 

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[3] Wang Y, Zhao Y, Bollas A,etal. Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications[J]. Nature Biotechnology,2021,39(11):1348-1365.

 

[4] Kasianowicz JJ. Some Physics and Applications for DNA TransportThrough Single Nanopores. APS Meeting Abstracts, 2002.

 

[5] Butler TZ,Pavlenok M,Derrington IM, etal.Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein manopore[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(52):20647-20652.

 

[6] Manrao EA,Derrington IM,Laszlo AH,etal.Reading DAN at single-nucleotide resolution with a mutant MspA manoproe and phi29 DNA polymerase[J].Nat Biotechnol,2012,30(4):349-353.

 

[7] Zhou W Y, Tang D S , Yu-Bao Li , et al. Self-organized formation ofhexagonal Namopore arrays in anodic alumina [J]. Chinese Physics:English Version, 2001.

 

[8] Yuan Z,Wang C,Yi X,etal. Solid-statenanopore[J]. Nanoscale Res Lett,2018,13(1):56.

 

[9] 田李，張穎，趙云峰．新一代測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用[J]．生物技術(shù)通報，2015,31(11):1-8.

 

[10] 張小珍，尤崇革．下一代基因測序技術(shù)新進展[J]． 蘭州大學學報（醫(yī)學版），2016,42(3):73-80.

 

[11] 莊子，孟雨桐，劉潤旸等.納米孔測序技術(shù)及其在病原學診斷中的應(yīng)用進展[J].江蘇大學學報（醫(yī)學版），2023,33（6）：502-508

 

[12] 劉可君, 郭世富, 崔樂等.基因測序技術(shù)在臨床檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用及國內(nèi)外監(jiān)管現(xiàn)狀比較研究[J].中國藥事，2018,32（11）：1520-1530