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色譜分析已經(jīng)普遍應(yīng)用在藥物分析中，論及色譜圖的靈魂當(dāng)屬積分方法，積分方法無論是在檢驗數(shù)據(jù)獲取中，還是分析方法驗證中均發(fā)揮著舉足輕重的作用，為了更接近數(shù)據(jù)的真實性和合理性，一套分析方法的積分方法需一致，對照品和供試品的積分需一致，然而因為某一張色譜圖的基線波動，或者是因為雜質(zhì)較多，為了保證每個色譜峰積分合理的積分方法該如何設(shè)置呢，積分方法中的功能除了峰寬和閾值（或者斜率），還有哪些功能是發(fā)揮著積極作用的呢，本文將結(jié)合具體實例對積分方法的設(shè)置進(jìn)行解析，希望可以為廣大同行帶來一些啟發(fā)。

外標(biāo)法定量中的積分

外標(biāo)法定量的積分的對象如果是含量測定項，一般以等度方式洗脫，濃度基本是以幾十到幾百μg/ml的供試品濃度作為分析物，獲得的色譜圖相對來說基線穩(wěn)定，積分難度不高，一般積分設(shè)置中將溶劑峰禁止，峰寬和閾值，最小峰面積設(shè)置好保證不同線性水平和外標(biāo)濃度水平的主成分色譜峰的積分合理（非過小或過大）就可以。但是在有關(guān)物質(zhì)檢查中就會出現(xiàn)一些比較麻煩的情況，以API的有關(guān)物質(zhì)中的雜質(zhì)定量分析為例，本例中的特征是主成分色譜峰在色譜柱中表現(xiàn)為超載的平頭峰，也是本例中積分的難點如何使主峰在積分中為單一色譜峰，同時雜質(zhì)峰的積分沒有過度積分或者積分較小。供試品溶液的色譜圖如圖1所示，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B均采用外標(biāo)法定量分析，本圖中的積分嘗試過程為：設(shè)置峰寬30，閾值1或者100，結(jié)果主峰為雙峰；設(shè)置峰寬150，閾值1或者120，主峰可實現(xiàn)單峰，但是雜質(zhì)A和雜質(zhì)B表現(xiàn)為無法積分或者積分不當(dāng)；為了使主峰為單峰積分合理，需要較大的峰寬值和閾值，但是勢必造成雜質(zhì)的積分不當(dāng)，此時打開積分事件，可以進(jìn)行細(xì)化的積分，比如在雜質(zhì)出峰的時間范圍內(nèi)設(shè)置峰寬，將峰寬值設(shè)置較小，看看積分結(jié)果，但是本例中仍然未實現(xiàn)良好雜質(zhì)積分；最后，選擇積分事件中的強(qiáng)破峰，將多圖重疊在一起，選擇雜質(zhì)出峰的合理的時間范圍進(jìn)行強(qiáng)迫峰，最后實現(xiàn)了主峰和雜質(zhì)的同時有效的積分。作者認(rèn)為在特殊環(huán)境中應(yīng)用強(qiáng)迫峰的設(shè)置，但是需要系統(tǒng)的穩(wěn)定，即各組分的保留時間比較一致，并且對照品溶液和供試品溶液中的雜質(zhì)峰均積分合理的情況下使用。

峰面積歸一化定量中的積分

以API的有關(guān)物質(zhì)方法中的雜質(zhì)測定為例，方法采用梯度洗脫的方式，在梯度變化較快或者梯度范圍比較大的情況下，勢必會在色譜圖中的某個未出峰的時間范圍內(nèi)有基線的波動，而面積歸一化法的定量方式需要把忽略限以上的所有雜質(zhì)和主峰準(zhǔn)確的積分，然后進(jìn)行計算，倘若某個雜質(zhì)積分過大或者過小，把基線當(dāng)成雜質(zhì)進(jìn)行積分了，那么會造成計算結(jié)果的偏離。本例中的色譜圖中有一段未出峰的位置存在基線波動，如圖2所示，本圖中的積分嘗試過程為：設(shè)置峰寬50，閾值3或者30，設(shè)置縫寬150，閾值1或者50，基線波動的一段總是被積分上，但明顯不是一個色譜峰，那么如何設(shè)置此時間段不積分呢，此時需要提示一個關(guān)于積分禁止的使用，如果不需要積分某一段，直接使用積分禁止是非常方便的，但是積分禁止的使用需要供試品色譜圖和空白溶劑或者空白輔料完全重合才使用，像本例中的這用情況，也許是供試品中的某些基質(zhì)造成的基線波動，那么在設(shè)置積分的時候可以選擇積分事件中的按時間強(qiáng)迫基線，但是作者在多數(shù)選用的時候效果并不顯著，可以選擇最小峰面積，根據(jù)方法中規(guī)定是有忽略限的，那么忽略限的峰面積可以將其設(shè)置成最小峰面積，但是這種基線波動往往能達(dá)到遠(yuǎn)大于忽略限的峰面積，此時可以選擇基線波動的起點時間，選擇最小峰面積設(shè)置為一個足夠的數(shù)值，然后在基線波動的終點時間，選擇最小峰面積設(shè)置為忽略限的峰面積（比如本例中的忽略限最小峰面積為10000，那么在積分事件中可以設(shè)置6min最小峰面積200000，14min最小峰面積10000），這樣就可以使基線波動的干擾避免，得到相對真實的峰面積歸一化的含量。作者認(rèn)為在進(jìn)行這樣的積分事件設(shè)置前，需要對整個方法學(xué)驗證過程中的所有色譜圖進(jìn)行審查或者根據(jù)先驗知識（之前的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)等），供試品溶液中在此時間段是否有雜質(zhì)出現(xiàn)。

主成分自身對照法定量中的積分

以有關(guān)物質(zhì)方法中同時測定特定雜質(zhì)E、F、G和未知雜質(zhì)的含量，定量方法的選擇為加或者不加校正因子的主成分自身對照法，此時需要明確在定量中需要用到自身對照的面積，那么本例中的積分重點是特定雜質(zhì)E、F、G和自身對照的峰面積，在設(shè)置積分參數(shù)的時候，需要保證特定雜質(zhì)E、F、G和自身對照的積分相對合理，即使出現(xiàn)主成分在供試品濃度下的色譜峰出現(xiàn)了積分過小的情況也沒有影響，只要保證待測雜質(zhì)和主成分自身對照的峰面積積分合理就能得到相對準(zhǔn)確的測定結(jié)果。

綜上所述，積分合理性是積分方法設(shè)置的前提，所謂積分合理就是保證待測定組分的積分沒有過大或者過小，相對合適。在不同的定量環(huán)境中，積分方法的選擇的側(cè)重點是有差異的，比如外標(biāo)法和主成分自身對照法中均需要保證在限度濃度水平中的積分是合理的，待測定的雜質(zhì)的積分是合理的。在峰面積歸一化的積分中，需要把所有的雜質(zhì)和主峰均良好的積分，不必要的基線波動不能作為雜質(zhì)峰積分，容易造成雜質(zhì)定量中偏差。另外，在方法學(xué)驗證中因為定量限檢測限，強(qiáng)制降解試驗的各自的特點，是允許單獨(dú)的積分方法設(shè)置的。希望本文的中的積分方法的小設(shè)計可以給同行們的色譜圖處理中帶來一些參考。