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      色譜柱及其固定相的發(fā)展是色譜分析技術(shù)中的重要組成部分，其發(fā)展歷程體現(xiàn)了科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和創(chuàng)新。今天來跟大家聊聊對(duì)色譜柱及其固定展以及工作中色譜柱選擇。

 

1、液相色譜柱的發(fā)展

 

1、早期發(fā)展

 

      液相色譜柱最初多采用碳酸鈣、硅膠、氧化鋁等填充的玻璃柱管，流動(dòng)相通過重力作用向下遷移，組分的檢測(cè)則依靠肉眼觀察或吸附劑從柱管中取出后的進(jìn)一步分析。這一階段的液相色譜柱效和分離能力相對(duì)較低。

 

     六十年代至七十年代：六十年代，隨著氣相色譜知識(shí)的積累，氣相色譜中的系統(tǒng)理論與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)被應(yīng)用于液相色譜研究，細(xì)粒度高效填充色譜柱的研制成功大大提高了液相色譜的分離能力。

 

      七十年代，高壓泵的應(yīng)用替代了重力作用，使得流動(dòng)相能夠更高效地通過色譜柱，進(jìn)一步提高了柱效率和分析速度。同時(shí)，適合分離生物大分子的填料成為研究熱點(diǎn)，推動(dòng)了液相色譜柱在生物化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

 

      八十年代至今：八十年代以后，液相色譜柱的制造技術(shù)不斷改進(jìn)，填料粒徑不斷降低，更高的柱效得以實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，色譜柱的材質(zhì)、形狀等也經(jīng)歷了多次革新，如球形顆粒的廣泛應(yīng)用提高了分離效率。

 

      九十年代以來，超高壓力液相色譜（UPLC）的出現(xiàn)極大提高了分離效率，使得液相色譜可以應(yīng)用于更加廣泛的領(lǐng)域。此外，非線性色譜、工業(yè)色譜技術(shù)等也獲得了長足的發(fā)展，推動(dòng)了液相色譜柱技術(shù)的多元化應(yīng)用。

 

2、亞2μm顆粒

 

      1956年，Van Deemter 就給出了使用非常小的顆粒進(jìn)行快速、高效分離的預(yù)測(cè)在過去幾年中，典型填料的粒徑不斷減小，21世紀(jì)初的研究主要集中在亞2pm的硅膠顆粒上。正如預(yù)測(cè)的那樣，這些粒子 (例如，1.7pm)可以產(chǎn)生卓越的性能 (約280000塊塔板/m或約4pm/塊塔板)。然而，填充亞2pm粒子的色譜柱會(huì)產(chǎn)生高的背壓，通常采用填充內(nèi)徑為2.1mm的色譜柱的方式，通過黏性發(fā)熱減小效率損失。

 

     對(duì)高壓力和低分散(減少附加柱的譜帶展寬)系統(tǒng)的要求導(dǎo)致了現(xiàn)代UHPLC系統(tǒng)的特點(diǎn)。進(jìn)一步降低粒徑至小于1.5μm可能會(huì)產(chǎn)生更高的速度和性能。然而，它也必須伴隨著系統(tǒng)壓力的大幅增加和毛細(xì)管色譜柱內(nèi)徑的減小。核殼結(jié)構(gòu)顆粒Kirkland熔融的核或者核殼粒子可以減小質(zhì)量轉(zhuǎn)移過程中的阻力。近年來研發(fā)的第一個(gè)核殼粒子具有如下特點(diǎn)：2.7μm表面多孔硅材料，無孔的核心 (1.7μm)和多孔的殼層(厚0.5μm)。這些亞3μm的顆粒與亞2pm的完全多孔材料相比似乎具有相似的效率，但是可以產(chǎn)生更低的壓降。這種特殊的性能可能是由于殼體較短的擴(kuò)散路徑，或者比較狹窄的填料分布。

 

     由于快速分離和在生物分子方面的應(yīng)用，核殼色譜柱迅速獲得廣泛的接受。越來越多的制造商可以提供各種鍵合相和不同尺寸的粒子(1.3μm，1.7μm, 2.6μm，1.3μm和5μm。因此，與多孔微細(xì)顆粒的色譜柱相比，這些色譜柱在所有應(yīng)用中具有很強(qiáng)的競(jìng)爭力。雜化將有機(jī)基團(tuán)引入到無機(jī)硅基體中形成雜交顆粒的理念在20世紀(jì)70 年代首次由Un-ger提出，然而第一根具有甲基基團(tuán)的商業(yè)化的色譜柱在1999年才正式推出。與傳統(tǒng)pH范圍為2~8的具有常規(guī)單功能鍵合的硅顆粒相比，這些混合物中的鍵合相被證明具有很好的pH穩(wěn)定性(pH范圍為1-12)和較低的親硅基活性。2005 年，引入第二代橋聯(lián)乙烯雜化(BEH)，在高 pH值流動(dòng)相以及UHPLC的應(yīng)用上獲得了極好的反響。

 

     硅膠基質(zhì)鍵合相由于批次之間重現(xiàn)性較好，仍是應(yīng)用領(lǐng)域主要的產(chǎn)品。但是，新的鍵合化學(xué)反應(yīng)使困難的分離(如極性嵌入式、苯基、己基苯基、氰基、戊烷氟苯基鍵合)的pH值穩(wěn)定范圍更寬(多官能的硅烷化學(xué)鍵或異丙基保護(hù)的硅烷)，選擇性增強(qiáng)。最近的一個(gè)創(chuàng)新方法稱為表面帶電雜化(CSH) 技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)于2010年引入，由于在酸性、低離子強(qiáng)度流動(dòng)相 (如0.1%甲酸)條件下，對(duì)高堿性分析物的峰形的改善，該項(xiàng)技術(shù)立即在藥物分析領(lǐng)域獲得了很好的接受度。親水作用色譜(HILIC)在反相 HPLC條件下，若流動(dòng)相中有機(jī)物含量比較低，就會(huì)導(dǎo)致相坍塌現(xiàn)象(鍵合相脫水)，許多強(qiáng)極性化合物就無法獲得足夠的保留時(shí)間或者會(huì)存在問題。

 

     20世紀(jì)90年代由Alpert首次開發(fā)了 HILIC模式，使用親水固定相(硅、二醇、氰基、氨基兩性離子等)，以水和乙睛作為流動(dòng)相，在極性藥物分析、輔助藥物代謝、氨基酸、多腦、神經(jīng)遞質(zhì)、低聚糖、碳水化合物、核昔酸或核昔方面的分析中越來越受歡迎。HILIC的實(shí)際保留機(jī)制可以認(rèn)為是分析物分子“分區(qū)”到附著在親水結(jié)合基團(tuán)的水層。與RPLC相比，HILIC其他突出的優(yōu)勢(shì)包括“正交”選擇性(樣品制備兼容兩種模式)，對(duì)質(zhì)譜具有更高的電噴霧離子化靈敏度 (515倍)，較低的操作壓力。

 

2、固定相的發(fā)展

 

類型與選擇：固定相的選擇對(duì)樣品的分離起著重要作用。不同類型的色譜采用的固定相也不同，如正相色譜采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相），反相色譜則用非極性固定相（如C18、C8），離子交換色譜中的固定相則是各種離子交換劑等。

 

發(fā)展歷程：早期使用的固定相粒徑較大，分離效率有限。隨著技術(shù)的進(jìn)步，研究人員不斷嘗試使用微粒固定相以提高柱效，如科克蘭等制備成功的薄殼型固定相就實(shí)現(xiàn)了高速傳質(zhì)。七十年代后，全多孔球形硅膠等新型固定相的出現(xiàn)進(jìn)一步提高了柱效和穩(wěn)定性。同時(shí)，鍵合固定相的發(fā)展使得色譜柱能夠多次使用而不失活。九十年代以來，隨著對(duì)分離選擇性的要求不斷提高，人們開始嘗試改變流動(dòng)相的組成以提高選擇性。此外，新型高分子材料作為固定相的研究也取得了顯著進(jìn)展，為色譜固定相的發(fā)展提供了新的方向。

 

當(dāng)前趨勢(shì)：目前，HPLC固定相基質(zhì)中硅膠的應(yīng)用約占75%，聚合物約占20%。同時(shí)，隨著對(duì)復(fù)雜樣品分離需求的增加，研究人員正在不斷探索新型固定相材料以提高分離效率和選擇性。值得注意的是，整體柱（Monolithic Column）作為一種新型色譜柱技術(shù)近年來受到了廣泛關(guān)注。整體柱具有制備簡單、傳質(zhì)阻力小、耐壓能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在復(fù)雜樣品分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。

 

3、液相色譜柱選擇的簡單思路

 

1、確定分離目的確定你的應(yīng)用是否要求高分離度、短分析時(shí)間、高靈敏度、長柱壽命，低的實(shí)驗(yàn)成本等。

 

2、評(píng)估分析物的化學(xué)性質(zhì)評(píng)估分析物的化學(xué)性質(zhì)。諸如化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶解性、穩(wěn)定性等。

 

3、選擇合適的色譜柱了解色譜填料的物理和化學(xué)性質(zhì)。

 

4、液相色譜柱選擇的條件

 

1、填料基質(zhì)

 

（1）硅膠基質(zhì)：純度高本錢低，強(qiáng)度大，化學(xué)修飾輕易，但pH值范圍有限。大多硅膠基質(zhì)填料在pH 2-8之間穩(wěn)定，但經(jīng)過特殊修飾的硅膠鍵合相可以穩(wěn)定在pH 1.5-10。

 

（2）聚合物基質(zhì)：應(yīng)用pH值范圍寬，溫度穩(wěn)定(高溫可以達(dá)到80℃以上)，機(jī)械強(qiáng)度小。

 

2、顆粒外形

 

     大多現(xiàn)代HPLC填料都是球形顆粒，但有時(shí)是不規(guī)則的顆粒。球形顆粒提供較低的柱壓、較高的柱效和穩(wěn)定性以及較長的柱壽命在使用高粘度的活動(dòng)相時(shí);不規(guī)則顆粒有較大比表面積和相對(duì)低廉的價(jià)格。

 

3、顆粒粒徑

 

     粒徑越小柱效越高、分離度越高，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致較高柱壓降。選擇1.5-3μm的填料以解決一些復(fù)雜樣品，UPLC可以使用1.5μm的填料，另外10μm或更大粒徑的填料用作半制備或制備柱。

 

4、含碳量

 

     含碳量指的是硅膠表面鍵合相的比例，與比表面積和鍵合覆蓋度等有關(guān)。高含碳量進(jìn)步柱容量、分辨率及分析時(shí)間，用于要求高分離度的復(fù)雜樣品；低含碳量分析時(shí)間短、展現(xiàn)不同的選擇性，用于快速分析簡單樣品及需要高含水活動(dòng)相條件的樣品。一般C18的含碳量在7-19%不等。

 

5、孔徑和比表面積

 

     HPLC吸附介質(zhì)是多孔的顆粒，盡大多數(shù)的反應(yīng)表面于孔內(nèi)。因此，分子必須進(jìn)進(jìn)孔內(nèi)才能被吸附和分離?？讖胶捅缺砻娣e是相輔相成的兩個(gè)概念?？讖叫”缺砻娣e大，反之亦然。比表面積大，增加樣品與鍵合相之間的反應(yīng)，增加保存,上樣量和復(fù)雜成分的分離度;比表面積小，平衡時(shí)間快，適合梯度分析。

 

6、孔容和機(jī)械強(qiáng)度

 

     孔容，又稱“孔體積”。指單位顆粒的空隙體積大小。它能很好的反應(yīng)填料的機(jī)械強(qiáng)度?？左w積大的填料相對(duì)孔體積小的填料機(jī)械強(qiáng)度要略弱?？左w積為1.5mL/g或更小的填料大多用于HPLC分離，而孔體積大于1.5mL/g的填料使用于尺寸排阻色譜和低壓色譜。

 

7、封端

      封端能夠降低極性堿性化合物由于與裸露的硅醇基相互作用而產(chǎn)生的拖尾峰。不封端鍵合相相對(duì)封端鍵合相會(huì)產(chǎn)生不同的選擇性，尤其是極性樣品。