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氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析不同產(chǎn)地馬蹄金揮發(fā)性成分

嘉峪檢測網(wǎng) 2024-08-23 20:19

摘要： 為探究不同產(chǎn)地馬蹄金的揮發(fā)性成分，建立氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對河北、廣西、四川、貴州、浙江5個產(chǎn)地的馬蹄金樣品揮發(fā)性成分進行測定，采用面積歸一化法計算各成分的相對含量。稱取0.5 g馬蹄金樣品，以乙酸乙酯為提取溶劑，冷浸2 h，低溫超聲提取30 min，濾液作為樣品溶液。通過譜庫檢索，5個產(chǎn)地馬蹄金的揮發(fā)性成分中共鑒定出有機酸、醇、烯、酯、烷烴等35種化合物，其中14種是共有成分，6種是產(chǎn)地特有成分，相對含量較高的揮發(fā)性成分分別為十六烷酸、亞油酸、樺木醇、α-亞麻酸、β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇，相對含量分別為27.99%、13.14%、12.91%、11.83%、11.64%、8.16%、5.28%。該方法可對馬蹄金中多種揮發(fā)性成分進行定量分析，為馬蹄金的質(zhì)量控制和藥效研究提供參考。

關鍵詞： 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；馬蹄金；揮發(fā)性成分；中藥產(chǎn)地

馬蹄金為旋花科植物馬蹄金的干燥全草，主要產(chǎn)于四川、貴州等地，是苗族常用的植物藥[1?2]。其性平，味苦、辛，歸肺、肝經(jīng)，具有清熱利尿、祛風止痛、止血生肌、消炎解毒、殺蟲、增強免疫、抗癌等功效，可用于治療急慢性肝炎、黃疸型肝炎、膽囊炎、腎炎、泌尿系統(tǒng)感染、扁桃腺炎等癥[3?6]。長期以來，對馬蹄金的研究多數(shù)集中在藥理活性、安全性評價及種植技術等方面，如江增宏等[5]對馬蹄金素衍生物體內(nèi)抗HBV藥效學的研究，覃冬杰等人[7]建立馬蹄金10種真菌毒素的液質(zhì)聯(lián)用的檢測方法。然而關于不同地區(qū)、不同用藥部位研究較少。筆者團隊在前期工作中對馬蹄金的性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、水分及灰分等檢驗項目進行了研究，并以蘆丁為內(nèi)參比峰建立馬蹄金指紋圖譜及含量測定法[8]?，F(xiàn)代研究表明，馬蹄金的化學成分主要包含植物甾醇、有機酸、黃酮、揮發(fā)油、糖類和微量元素等[7]，其中揮發(fā)油主要包含單萜烯類、倍半萜烯類及其含氧衍生物等[9]。對馬蹄金其揮發(fā)性成分分析，可為闡明其藥理作用和藥效研究提供參考研究數(shù)據(jù)，為提高整體質(zhì)量控制提供參考方法。

中藥材揮發(fā)性成分復雜多樣，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(GC-MS)結合氣相色譜的分離和質(zhì)譜檢測器的優(yōu)點，在中藥材復雜揮發(fā)性物質(zhì)的分析中應用日益廣泛[10?12]。筆者采用低溫超聲方法對馬蹄金中揮發(fā)性成分進行提取，經(jīng)氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分離鑒定，并結合計算機檢索技術，分析馬蹄金中揮發(fā)性成分種類，應用峰面積歸一化法計算各成分的相對含量，同時比較不同產(chǎn)地馬蹄金揮發(fā)性成分的差異性，以分析中藥市場馬蹄金飲片的質(zhì)量情況，為其臨床應用和質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1、實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：GC2030/TQ8040型，日本島津公司。

電子分析天平：XS105型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

超聲波振蕩器：KQ-500DB型，昆山市超聲儀器有限公司。

馬蹄金藥材樣品：共10批，經(jīng)鑒定為旋花科植物馬蹄金的干燥全草。產(chǎn)地及編號：1#～2#產(chǎn)自河北；3#～4#產(chǎn)自廣西；5#～6#產(chǎn)自四川；7#～8#產(chǎn)自貴州；9#～10#產(chǎn)自浙江。

乙酸乙酯：分析純，康科德科技有限公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 氣相色譜儀

色譜柱：島津HP-17MS毛細管柱[30 m×0.25 mm，0.25 μm，島津（上海）實驗器材有限公司]；載氣：高純氦氣(體積分數(shù)不小于99.999%)，流量為1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；進樣方式：分流進樣，分流比為20∶1；進樣體積：1 μL；升溫程序：起始溫度60 ℃，保持3 min，以10 ℃/min的速率升至180 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率升至300 ℃，保持10 min。

1.2.2 質(zhì)譜儀

接口溫度：300 ℃；電離方式：電子轟擊源(EI)；電離能量：70 eV；離子源溫度：280 ℃；溶劑延遲：4 min；數(shù)據(jù)掃描模式：全掃描；掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)：55～550。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品溶液的制備

取馬蹄金適量，粉碎，過孔徑為（250±9.9） μm的篩，稱取粉末0.5 g，加乙酸乙酯25 mL，冷浸2 h，冷水中超聲(功率200 W，頻率30 kHz)處理30 min，0.22 μm濾膜濾過。

1.3.2 樣品分析

取馬蹄金樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進行測定，通過色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)工作站進行數(shù)據(jù)處理，參考美國國家標準與技術局(NIST20)譜庫檢索，并結合相關參考文獻進行圖譜分析，對馬蹄金中揮發(fā)性成分進行定性，采用峰面積歸一化法計算各組分相對含量。

2、結果與討論

2.1 氣相色譜條件的優(yōu)化

升溫程序的優(yōu)化參考梁光義等[9]測定出的馬蹄金揮發(fā)油升溫程序，測定不同產(chǎn)地馬蹄金揮發(fā)性成分，確定起始溫度60 ℃，并采用兩個階段的升溫程序。首先，比較第一階段不同升溫速率對分離度的影響，分別以10、20 ℃/min升溫到180 ℃，在以20 ℃/min 升溫時，馬蹄金中低沸點的揮發(fā)性成分出峰較快，但是分離度較差；將升溫速率降至10 ℃/min，各成分的分離度提高，各組分干擾較小，且基線更為平穩(wěn)，滿足面積歸一化定量要求，因此確定第一階段升溫速率為10 ℃/min。其次，確定升溫程序的最高溫度，比較在270 ℃和300 ℃下色譜圖中峰的種類和分離度，由于馬蹄金的揮發(fā)性成分主要為單萜烯類、倍半萜烯類及含氧衍生物，多為高沸點化合物，在300 ℃時色譜峰更豐富，分離度更好，因此確定最高溫度為300 ℃。

考查島津HP-17MS和島津HP-5MS毛細管柱對馬蹄金揮發(fā)性成分分離的影響。分別使用以上兩種毛細管柱，進行升溫程序優(yōu)化，結果表明，在最佳升溫程序下，使用島津HP-17MS毛細管柱，馬蹄金中各揮發(fā)性組分的分離效果更好，故選擇島津HP-17MS毛細管柱。

2.2 樣品溶液制備方法的優(yōu)化

在馬蹄金樣品溶液制備過程中，使用不同提取溶劑，分別為乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、石油醚(60～90 ℃)，考查不同提取溶劑對馬蹄金揮發(fā)性成分分離的影響。不同提取溶劑馬蹄金樣品揮發(fā)油總離子流色譜如圖1所示。從圖1中可以看出，以乙酸乙酯為提取溶劑，基線平穩(wěn)，色譜峰數(shù)量多且色譜峰有良好的對稱性，各組分無干擾。在馬蹄金樣品超聲提取過程中，水溫隨著超聲時間延長逐漸升高，為防止馬蹄金揮發(fā)性成分的損失，所有的提取過程均在低溫環(huán)境下進行。采用超聲揮發(fā)性成分提取方法，考察在冷水中超聲提取10、20、30、60 min的提取效果，結果發(fā)現(xiàn)，超聲30 min有效溶出成分最佳。此外，樣品在乙酸乙酯冷浸2 h，可充分分散浸濕，從而顯著增加揮發(fā)性成分的提取量，因此最終確定樣品制備方法為稱取樣品0.5 g，乙酸乙酯為溶劑，浸泡2 h，超聲處理30 min。

圖1 不同提取溶劑馬蹄金樣品揮發(fā)油總離子流色譜圖

Fig.1 Total ion chromatograms of dichondra in different extraction solvents

1—二氯甲烷；2—石油醚；3—正己烷；4—乙酸乙酯

2.3 馬蹄金揮發(fā)性成分定量方法

馬蹄金樣品溶液色譜圖利用NIST20譜庫檢索，共鑒定出35種揮發(fā)性成分，主要為有機酸、單萜烯類、倍半萜烯類等，由于市場未全部提供已知成分的對照品，為分析比較不同產(chǎn)地馬蹄金揮發(fā)性成分差異，采用面積歸一化法計算各揮發(fā)性成分的相對含量。

2.4 不同產(chǎn)地揮發(fā)性成分對比分析

經(jīng)過譜庫檢索和結構分析，確定馬蹄金主要揮發(fā)性成分為十六烷酸、亞油酸、樺木醇、α-亞麻酸、β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇。有研究報道，α-亞麻酸可降解血栓，使血流順暢，使血壓降低，還具有改善過敏性皮炎、花粉癥、氣管哮喘等疾病[14]。植物甾醇具有良好的抗炎、降血脂作用[15]，馬蹄金共有揮發(fā)性成分樺木醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、可能是馬蹄金治療各類炎癥、降低血脂的關鍵物質(zhì)，此外樺木醇具有消炎、抗病毒、抗腫瘤作用[16]。

采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對5個產(chǎn)地的10 批次馬蹄金藥材揮發(fā)性成分進行測定，圖2為各產(chǎn)地典型馬蹄金樣品揮發(fā)油總離子流色譜圖，從圖2中可以看出，5個產(chǎn)地馬蹄金共鑒定出揮發(fā)性成分35種，主要為鏈狀脂肪族化合物和萜類化合物，其中廣西產(chǎn)地揮發(fā)性成分最多(28種)，其次是四川(27種)、貴州(26種)、浙江(22種)、河北(21種)，馬蹄金中相對含量較高的揮發(fā)性成分分別為十六烷酸、亞油酸、樺木醇、α-亞麻酸、β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇。

圖2 各產(chǎn)地典型馬蹄金樣品揮發(fā)油總離子流色譜圖

Fig.2 Total ion chromatograms of dichondra from various resources

表1為5個產(chǎn)地馬蹄金揮發(fā)性成分相對含量測定結果。由表1可知，35種揮發(fā)性成分中，有14種是產(chǎn)地共有成分，主要包括脂肪族化合物和萜類化合物。表2為馬蹄金中7種主要揮發(fā)性成分相對含量，圖3為5個產(chǎn)地典型馬蹄金樣品主要成分熱圖。由表2、圖3可知，5個產(chǎn)地馬蹄金揮發(fā)性成分中，十六烷酸相對含量均為最高，并存在著地域性差異，其中浙江產(chǎn)地相對含量為26.87%、廣西產(chǎn)地相對含量為24.28%，以上兩產(chǎn)地較高，河北產(chǎn)地相對含量為14.60%，此產(chǎn)地最低；另外亞油酸、α-亞麻酸同樣存在著地域性差異，且脂肪酸中的亞油酸、α-亞麻酸具有降低血脂、軟化血管、降低血壓、促進微循環(huán)的作用[13]，由此推測，其降血脂等功效可能不同。十六烷酸、亞油酸、α-亞麻酸、β-谷甾醇、樺木醇是馬蹄金中主要的揮發(fā)性物質(zhì)，四個組分相對含量之和分別為57%(河北)、65%(廣西)、62%(貴州）、62%(四川)、66%(浙江)，五種組分相對含量之和均超過揮發(fā)性成分總量一半，這可能是馬蹄金抗炎、抗腫瘤、增強免疫的主要化學成分。此外，共有成分中包含己內(nèi)酮、植酮等微量組分。檢出的揮發(fā)性成分有6種是產(chǎn)地特有成分，其中河北2種(環(huán)氧十八烷及1種未鑒定)，廣西3種(δ-十二內(nèi)酯、3-十六酮及1種未鑒定)，四川1種(石竹素)。由于不同產(chǎn)地的地域環(huán)境差異較大導致馬蹄金揮發(fā)性成分的差異，可能會對藥理作用產(chǎn)生一定的影響。對不同產(chǎn)地馬蹄金揮發(fā)性成分進行分析比較，5個產(chǎn)地馬蹄金揮發(fā)性成分的種類和相對含量既有彼此間共性，也存在自身特性。各產(chǎn)地馬蹄金主要揮發(fā)性成分為有機酸、單萜烯類和倍半萜烯類，其中主要包含十六烷酸、亞油酸、α-亞麻酸和植物甾醇類，但相對含量存在差異性，一定程度上反應中藥材市場馬蹄金質(zhì)量參差不齊現(xiàn)狀。馬蹄金各生長氣候條件、土壤狀況、緯度、海拔高度、日照強度、栽培條件、采集季節(jié)以及藥材的儲存條件等因素有關，可能會引起馬蹄金藥理活性、藥效功能產(chǎn)生改變的原因之一。其中廣西、貴州、四川產(chǎn)區(qū)鑒定出的化合物較多，地域環(huán)境較適應馬蹄金的生長，生長周期長且穩(wěn)定。河北產(chǎn)區(qū)鑒定出的化合物較少，全年溫差大，平均氣溫低，馬蹄金生長緩慢產(chǎn)量低，可能是化學成分較少的原因之一。

表1 5個產(chǎn)地馬蹄金揮發(fā)性成分鑒定及相對含量測定結果

Tab. 1 Identification and relative content determination of volatile components of dichondra from five areas

注：“-”表示未檢出；（1）表示5個產(chǎn)地共有成分；（2）表示各產(chǎn)地特有成分。

表2 馬蹄金中7種主要揮發(fā)性成分相對含量

Tab. 2 Relative content determination of seven volatile components of dichondra ( % )

圖3 5個產(chǎn)地典型馬蹄金樣品主要成分熱圖

Fig. 3 Heat map of main ingredients of dichondra from various resources

3、結語

建立氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術法對河北、廣西、四川、貴州、浙江5個產(chǎn)地的馬蹄金樣品揮發(fā)性成分進行測定，樣品溶液制備便捷，效率高，可對馬蹄金中多種揮發(fā)性成分定量，為市場流通馬蹄金質(zhì)量控制提供參考方法。經(jīng)過馬蹄金揮發(fā)性物質(zhì)分析，為馬蹄金抗癌、抗腫瘤、抗炎指引新的治療方向，后續(xù)研究其病理學及藥理學的相關性，為馬蹄金在臨床上的合理應用提供科學依據(jù)。

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引用本文：郭海平，楊紅梅，馬麗，等 . 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析不同產(chǎn)地馬蹄金揮發(fā)性成分［J］. 化學分析計量，2024，33（7）：79. (GUO Haiping, YANG Hongmei, MA Li, et al. Analysis of the volatile components from different origins of dichondra by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(7): 79.)

來源：化學分析計量

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析不同產(chǎn)地馬蹄金揮發(fā)性成分

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