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脂質(zhì)體是磷脂在水中形成的一種具有磷脂雙分子層的囊泡，粒徑一般在40 ～ 200 nm。脂質(zhì)體作為藥物載體廣泛應(yīng)用，藥物一般包封于脂質(zhì)雙分子層或內(nèi)水相中。包封率是脂質(zhì)體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，它指的是包封在脂質(zhì)中的藥物含量占總投藥量的百分比，能反映出脂質(zhì)體中藥物包封程度的高低，以指導(dǎo)制備工藝的改進(jìn)。由于包封藥物性質(zhì)不同，脂質(zhì)體形式不同，大小不同，包封率測定方法往往需要實驗考察，本文總結(jié)了包封率測定常用的一些方法，為脂質(zhì)體包封率測定的方法選擇提供一些參考。

1.     離心法：

原理：游離藥物與含藥脂質(zhì)體在介質(zhì)中的不同溶解性、離心力實現(xiàn)分離。脂溶性的游離藥物不溶于脂質(zhì)體所需的水相介質(zhì)，而懸浮在體系中，采用相對較小的離心強(qiáng)度和較短的離心時間，這些未溶的游離藥物會因離心力的作用而沉降，但脂質(zhì)體仍存在于上清液中，從而實現(xiàn)分離。超速離心則適合水溶性的藥物，超速離心后脂質(zhì)體會沉降而水溶性的藥物則溶解在上清液中實現(xiàn)分離。

優(yōu)勢：簡單、快速、成本較低。

缺點：離心脂質(zhì)體容易破裂，小粒徑脂質(zhì)體和游離藥物分離困難。

舉例：大黃酚脂質(zhì)體游離藥物容易行程顆粒結(jié)晶，采用低速離心法用空白脂質(zhì)體加上不同濃度的游離藥物考察離心強(qiáng)度（500-3000r/min）、離心時間（30-180S）、間歇和連續(xù)離心（1-8次）確定了包封率測定方法。

2.     超濾離心

原理：超濾離心法是將脂質(zhì)體放入配有超濾膜的超濾管中，在適宜的轉(zhuǎn)速下離心，游離藥物在離心力的作用下可通過超濾膜，而脂質(zhì)體則被截留，從而實現(xiàn)二者的分離。

優(yōu)勢：簡單，快速，不需要稀釋

缺點：脂溶性藥物或者蛋白質(zhì)等容易聚集的藥物不能透過超濾膜比較適用于水溶性藥物，但需要注意濃度極差現(xiàn)象發(fā)生（高濃度脂質(zhì)體截留在超濾膜上影響游離藥物通過），可嘗試通過稀釋和高速離心來解決。但高速離心容易導(dǎo)致脂質(zhì)體破裂。

舉例：甘草次酸脂質(zhì)體的包封率測定使用超濾離心法，考察超濾膜對空白脂質(zhì)體透過能力，游離藥物回收率、超濾加樣回收率，離心速度對藥物泄露影響等參數(shù)，最終確定了包封率測定方法。

3.     凝膠柱法

原理：葡聚糖顆粒在溶脹后可形成凝膠狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部具有一定大小的孔徑，小分子游離藥物可進(jìn)入孔內(nèi)，實現(xiàn)一定程度的保留；而脂質(zhì)體粒徑大于凝膠孔徑，脂質(zhì)體無法進(jìn)入孔內(nèi)，于是少量洗脫液便可將其洗脫下來。

優(yōu)勢：分離效果較好，不受藥物溶解性影響

缺點：大量洗脫液，可能導(dǎo)致脂質(zhì)體破裂。對吸附力較強(qiáng)的脂質(zhì)體洗脫困難，不太適用。一般可通過加大脂質(zhì)體樣品上柱量或用空脂質(zhì)體預(yù)先將柱子飽和來嘗試解決。

相比葡聚糖凝膠柱法，微柱離心法加入的洗脫液體積大大減小，避免了脂質(zhì)體因稀釋作用而發(fā)生的泄漏。此法是將溶脹好的葡聚糖凝膠或經(jīng)預(yù)處理的離子交換樹脂裝入注射器中，反復(fù)平衡、離心后制成干燥的微柱，然后在其頂端加入脂質(zhì)體混懸液，靜置幾分鐘后再加入洗脫液，設(shè)置適宜的離心轉(zhuǎn)速將脂質(zhì)體洗脫下來。

舉例：采用微柱離心?ＨＰＬＣ 測定胰島素脂質(zhì)體的包封率，考察了裝填方式，洗脫介質(zhì)，脂質(zhì)體和游離藥物的吸附，上樣體積，洗脫體積、洗脫次數(shù)等確定洗脫曲線分離脂質(zhì)體和游離藥物。

4.     固相萃取法

原理：固相萃取法利用的是色譜吸附原理，游離藥物被吸附在極性相近的 SPE 柱固定相上，而脂質(zhì)體在 SPE 柱上無保留，少量水便可洗脫下來。

優(yōu)勢：簡單快速，分離效果好

缺點：對藥物性質(zhì)要求較高，游離需要與SPF吸附性較強(qiáng)

舉例:紫杉醇脂質(zhì)體采用固相萃取方法進(jìn)行分離，對C18填料粒徑，篩板極性，洗脫體積進(jìn)行優(yōu)化確定了包封率測定方法。

5.     熒光法

原理：

Ri液狀態(tài)時，幾乎沒有熒光活性，與游離藥物結(jié)合時，其熒光活性將增加1000倍。熒光檢測器檢測得到游離藥物濃度。分別測定游離藥物濃度，以及總的藥物濃度，兩者的差值就是包封的藥物濃度。通過計算得到包封率結(jié)果。

優(yōu)勢：不需要分離脂質(zhì)體和游離藥物，檢測快速

缺點：適合產(chǎn)生熒光的藥物，一般用于mRNA、siRNA、pDNA等核酸檢測

舉例：將 RiboGreen 熒光染料加 入到共載米鉑與核酸 miR-34a 陽離子脂質(zhì)體溶液中，游離的 miR-34a 分子會與 RiboGreen 染料結(jié)合產(chǎn)生熒光，利用外標(biāo)法可以計算出游離miR-34a的 濃度，另取一份脂質(zhì)體破乳后測定 miR-34a 總濃 度，從而計算出包封率。

6.     納米粒子排阻色譜（nPEC）

原理：在nPEC固定相表面涂覆聚乙烯吡咯烷酮，以減少脂質(zhì)體對固定相中硅醇基的吸附。此外，固定相具有um-size的微孔和nm-size的介孔組成的雙峰結(jié)構(gòu)。與填料柱相比，采用這種設(shè)計的整體柱具有更低的背壓，產(chǎn)生更低的剪切力。雙峰結(jié)構(gòu)允許脂質(zhì)體容易流過微孔(2微米)，而游離藥物可以有效地穿透介孔(18納米)，這使得脂質(zhì)體制劑中的游離藥物可以同時分離和定量。采用HPLC方法測定總藥物含量，從而計算出包封率。

優(yōu)勢：不需要分離脂質(zhì)體和游離藥物，檢測快速

缺點：技術(shù)較新，目前應(yīng)用不廣泛

舉例：文獻(xiàn)報道了采用nPEC 方法測定水溶性藥物阿霉素脂質(zhì)體和一種疏水性藥物脂質(zhì)體的包封率，通過分離效果確定流動相、流速、保留時間等色譜參數(shù)，并對色譜條件下脂質(zhì)體的完整性進(jìn)行研究，最終對確定的色譜方法進(jìn)行方法驗證符合要求。

總結(jié)：除上述方法外，包封率測定方法還有魚精蛋白法，透析法等。總體而言，脂質(zhì)體包封率檢測方法選擇需要依據(jù)藥物的物理化學(xué)性質(zhì)和各種方法的特點來選擇，有些方法對藥物選擇性較高，如：魚精蛋白法適合帶負(fù)電和中性的脂質(zhì)體，熒光法適合有熒光反應(yīng)的藥物，這些方法可以作為具有這些性質(zhì)藥物的首選。超濾膜的材料和截留分子量有多種類型，可滿足試驗者的多重需要因此超濾法適用范圍較廣。凝膠柱和固相萃取法需要藥物在柱子中有一定保留，但吸附能力不能太強(qiáng)，此外，大量稀釋可能導(dǎo)致脂質(zhì)體破裂。納米粒子排阻色譜不需要對脂質(zhì)體和游離藥物進(jìn)行分離，適用范圍比較廣，但需要摸索合適的色譜參數(shù)。不管采用何種方法，脂質(zhì)體的完整性及脂質(zhì)體與游離藥物的分離度都是需要考慮的重點內(nèi)容。如果藥物適用，通過不同方法的相互印證，可以更加準(zhǔn)確的測出脂質(zhì)體的包封率。

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