中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

摘 要： 建立了一種柱前衍生化-高效液相色譜法測定透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料中透明質(zhì)酸鈉的含量，可有效實現(xiàn)復雜組成透明質(zhì)酸鈉凝膠產(chǎn)品的質(zhì)量控制。采用強酸將透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料中的透明質(zhì)酸鈉水解成氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸，利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮與單糖還原性末端反應的原理，將氨基葡萄糖衍生化后，采用高效液相色譜法進行檢測。采用Kromasil C18柱分離，以乙腈-0.025 mol/L乙酸銨溶液（pH 4.5）作為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃。透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量濃度在20~60 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關系良好，相關系數(shù)為0.999 6，平均加標回收率為98.47％，測定結(jié)果的相對標準偏差為1.1％（n=9）。該方法受產(chǎn)品其他處方組成干擾影響小、準確度高、精密度好，可實現(xiàn)快速準確地測定復雜組成透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料中的透明質(zhì)酸鈉的含量。

關鍵詞： 透明質(zhì)酸鈉； PMP衍生化； 含量； 高效液相色譜法

 

透明質(zhì)酸是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺通過β-1，3糖苷鍵連接成雙糖結(jié)構(gòu)單元，每個雙糖單元通過β-1，4糖苷鍵相連形成的鏈狀粘多糖。透明質(zhì)酸多以鈉鹽形式廣泛應用于食品、化妝品、藥品、醫(yī)療器械等領域[1-3]。2022年11月國家藥監(jiān)局發(fā)布了修訂《關于醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉產(chǎn)品管理類別的公告》，明確了不同預期用途和工作原理的透明質(zhì)酸鈉的邊緣產(chǎn)品、藥械組合產(chǎn)品的管理屬性和管理類別，加強透明質(zhì)酸鈉的產(chǎn)品監(jiān)督管理。目前含有透明質(zhì)酸鈉組分產(chǎn)品種類繁多[4-5]，制劑組分復雜，因此有必要建立一種能準確測定復雜組分產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉含量的方法，為透明質(zhì)酸鈉產(chǎn)品質(zhì)量控制提供方法支撐。

透明質(zhì)酸鈉檢測方法主要包括硫酸-咔唑法[6-7]、酶解法[8]、凝膠色譜法[9]、近紅外光譜法[10]。硫酸-咔唑法易受透明質(zhì)酸鈉產(chǎn)品組分中能與硫酸咔唑反應顯色物質(zhì)的干擾，如葡萄糖、海藻糖等；凝膠色譜法不適用于含有不同相對分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸鈉產(chǎn)品、且分析成本較高；酶解法將透明質(zhì)酸鈉水解成不飽和雙糖，采用高效液相色譜法進行分離測定，酶解法和近紅外光譜法主要適用于透明質(zhì)酸鈉原料的檢測，對于復雜制劑處方成分透明質(zhì)酸鈉產(chǎn)品目前暫無文獻報道。

透明質(zhì)酸鈉在強酸條件下水解可生成帶有還原性末端的氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸[11-12]。在堿性條件下，氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸均可以與1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)發(fā)生結(jié)合反應，1個單糖分子的還原端可與2個分子的PMP形成穩(wěn)定的衍生物[13-15]，該衍生物改變了單糖分子的極性、具有較強紫外吸收，可采用液相色譜分析[16-18]。筆者建立了一種高效液相色譜分析方法，用于分離PMP-氨基葡萄糖衍生物和PMP-葡萄糖醛酸衍生物，并以PMP-氨基葡萄糖衍生物作為透明質(zhì)酸鈉的定量峰，用于透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料中透明質(zhì)酸鈉的含量測定，該方法可以排除制劑處方中多種輔料的干擾，包括葡萄糖醛酸，海藻糖以及其他多種輔料成分，專屬性強，為復雜組分透明質(zhì)酸鈉產(chǎn)品中的透明質(zhì)酸鈉含量測定提供了方法參考。

 

1、 實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-2030C 3D型，附帶DAD檢測器、LC-Solution工作站，日本島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

單級四級桿高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：LC-MS 2020型，附帶LC-20AD高效液相色譜儀、DAD檢測器、質(zhì)譜檢測器（DUIS復合離子源）、LC-Solution工作站，日本島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

電子分析天平：QUINTIX35-1CN型，感量為0.01 mg，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9070A型，上海齊欣科學儀器有限公司。

pH（酸度）計：FiveEasyPlus型，梅特勒-托利多科技（中國）有限公司。

恒溫水浴鍋：HH-6型，常州國華電器有限公司。

超純水機：PURELAB flex2型，威立雅水處理技術(shù)(上海)有限公司。

離心機：DMO412型，賽洛捷克（美國）有限公司。

微型渦旋儀：WH-2型，上海滬西分析儀器廠。

鹽酸、氫氧化鈉：分析純，南京化學試劑股份有限公司。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、D-氨基葡萄糖鹽酸鹽、D-葡萄糖醛酸：優(yōu)級純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

甲醇、乙腈、二氯甲烷：色譜純，霍尼韋爾（中國）有限公司。

透明質(zhì)酸鈉對照品：純度（質(zhì)量分數(shù)）為97.5%，山東眾山生物科技有限公司。

透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料樣品、空白凝膠樣品：江蘇海智生物醫(yī)藥有限公司。

實驗用水為去離子水，由威力雅超純水水儀制得。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

色譜柱：Kromasil 100-5型C18柱[4.6 mm×250 mm，5 μm；諾力昂新材料（蘇州）有限公司]；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL；檢測波長：250 nm；流動相：A相為乙腈，B相為0.025 mol/L乙酸銨溶液(用乙酸調(diào)pH至4.5)，流量為1.0 mL/min，梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1   梯度淋洗程序

Tab. 1   Gradient washing program

 

1.2.2 質(zhì)譜儀

離子源：加熱型DUIS復合源，可同時進行電噴霧電離（ESI）和大氣壓化學電離（APCI）；電離模式：正負離子模式同時進行；檢測模式：多反應監(jiān)測（MRM）模式；霧化氣：高純氮氣；霧化氣流量：1.5 L/min；接口溫度：350 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；檢測器電壓：1.5 kV；紫外檢測器-質(zhì)譜檢測器柱后串聯(lián)分流比：1∶1；質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍：100～800；掃描速率：715 。

1.3 溶液配制

透明質(zhì)酸鈉對照品儲備溶液：精密稱取透明質(zhì)酸鈉對照品80 mg于20 mL容量瓶中，加入適量純水，于70 ℃水浴中充分溶脹溶解后，加水稀釋至標線，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為4 mg/mL的透明質(zhì)酸鈉對照品儲備溶液。

透明質(zhì)酸鈉對照品溶液：精密量取質(zhì)量濃度為4 mg/mL透明質(zhì)酸鈉對照品儲備溶液0.5 mL于20 ml頂空瓶中，加入5 mol/L鹽酸溶液5 mL，壓蓋，渦旋混勻后置于121 ℃烘箱中，加熱水解1.5 h，取出冷卻至室溫后，用純水完全轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加入5 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL中和，再加水稀釋定容至標線，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為40 μg/mL的透明質(zhì)酸鈉對照品溶液。

D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品溶液：精密稱取D-氨基葡萄糖鹽酸鹽10 mg于250 mL容量瓶中，加水溶解稀釋，定容至標線，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為40 μg/mL的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽對照品儲備溶液。

D-葡萄糖醛酸對照品溶液：精密稱取D-葡萄糖醛酸10 mg于250 mL容量瓶中，加水溶解稀釋,定容至標線，搖勻, 配制成質(zhì)量濃度為40 μg/mL的D-葡萄糖醛酸對照品溶液。

樣品溶液：精密稱取透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料樣品1 g于20 ml頂空瓶中，加入5 mol/L鹽酸溶液5 mL，壓蓋，渦旋混勻后置于121 ℃烘箱中，加熱水解1.5 h，取出冷卻至室溫后，用純水全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加入5 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL中和，再加水稀釋，定容至標線，搖勻，以0.45 μm水系濾頭過濾除去沉淀物，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

PMP-甲醇溶液：稱取1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮8.71 g于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，稀釋定容至標線，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液。

空白凝膠溶液：精密稱取空白凝膠1 g于20 mL頂空瓶中，與樣品溶液同法制備。

1.4 實驗步驟

1.4.1 衍生化反應

精密量取透明質(zhì)酸鈉對品溶液和樣品溶液各800 μL，分別置于15 mL螺口試管中，加入0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液0.8 mL、0.3 mol/L氫氧化鈉溶液800 μL，混勻，于70 ℃恒溫水浴中保溫100 min，取出，冷卻至室溫后，加入0.3 mol/L鹽酸溶液1 000 μL中止反應，混勻后，再加入二氯甲烷5 mL，渦旋萃取1 min，以3 500 r/min離心5 min，溶液分層，棄去二氯甲烷層，收集上層上清液作為衍生化樣品溶液。同法制備D-氨基葡萄糖鹽酸鹽、D-葡萄糖醛酸的衍生化樣品溶液、空白凝膠溶液和試劑空白。1.4.2 衍生物脫鹽處理

將C18固相萃取小柱(柱體積為1 mL)安裝在10 mL玻璃注射器上，先以5 mL的甲醇溶液沖洗小柱，接著用10 mL純水過柱平衡，然后將透明質(zhì)酸鈉對照品溶液，D-氨基葡萄糖衍生化樣品溶液，用純水稀釋至甲醇體積分數(shù)為1%，上樣，再以20 mL超純水沖洗小柱，用5 mL甲醇溶液洗脫并收集洗脫液，最后將洗脫液氮氣吹干冷藏保存，臨用前，用少量甲醇復溶后測定，用于液相色譜-質(zhì)譜結(jié)構(gòu)確證。

1.4.3 測定

取衍生化反應后的透明質(zhì)酸鈉對照品溶液及樣品溶液，在1.2色譜條件下進樣分析，記錄色譜圖峰面積，以外標法計算樣品中透明質(zhì)酸鈉的含量。

取脫鹽處理后的衍生物樣品，在1.2質(zhì)譜條件下進樣分析，掃描衍生物的質(zhì)荷比并進行結(jié)構(gòu)分析及確證。

 

2、 結(jié)果與討論

 

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

通過二極管陣列檢測器對PMP-氨基葡萄糖衍生物進行考察，圖1為PMP-氨基葡萄糖衍生物特征峰的紫外光譜圖，從圖1中可以看出，該衍生物在219 nm波長處有最大吸收，但是該波長條件下，溶液色譜圖中干擾峰較多，梯度洗脫基線波動較大。在240 nm~260 nm波段，PMP-氨基葡萄糖衍生物仍有較高響應，且峰響應值下降趨勢較為平緩，因此選擇250 nm作為PMP-氨基葡萄糖衍生物的測定波長，與文獻[12]報道檢測波長一致。

圖1   PMP-氨基葡萄糖衍生物特征峰的紫外光譜圖

Fig. 1   UV Spectrogram of Characteristic Peaks of Glucosamine- PMP Derivatives

2.1.2 流動相的優(yōu)化

在文獻[12]的基礎上選擇乙腈-乙酸銨緩沖鹽系統(tǒng)作為流動相，考察了乙酸銨緩沖溶液的pH、乙腈-乙酸銨緩沖溶液的比例對PMP-氨基葡萄糖衍生物分離的影響。

表2對比了不同色譜條件下PMP-氨基葡萄糖衍生物的分離效果，圖2為對應的色譜圖。由表2、圖2可知，在色譜條件4，即乙酸銨緩沖溶液pH用冰乙酸調(diào)節(jié)至4.5，流速為1.0 mL/min時，可改善PMP-氨基葡萄糖衍生物與相鄰雜質(zhì)峰的分離度，具體梯度洗脫程序見表2。

表2   不同色譜條件下PMP-氨基葡萄糖衍生物的分離效果

Tab. 2   Isolation effect of PMP glucosamine derivatives under different chromatographic conditions

 

 

圖2   不同色譜條件下PMP-氨基葡萄糖衍生物色譜圖

Fig. 2   Chromatograms of PMP glucosamine derivatives under different chromatographic conditions

1—氨基葡萄糖衍生物；2—透明質(zhì)酸鈉對照品；3—D-氨基葡萄糖鹽酸鹽；4—D-葡萄糖醛酸；5—透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品；6—空白凝膠

 

2.2 透明質(zhì)酸鈉水解產(chǎn)物定性分析

透明質(zhì)酸鈉[11,13-15]酸水解過程：首先多糖結(jié)構(gòu)的β-1，4糖苷鍵處發(fā)生斷裂，生成二糖；第二階段，部分二糖在高溫強酸的環(huán)境下繼續(xù)水解，產(chǎn)生氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸；第三階段，幾乎所有二糖全部轉(zhuǎn)化為單糖。在液相色譜分析中通過將D-氨基葡萄糖采用PMP標記后定位，確定了氨基葡萄糖衍生物的峰位(標記該組分為a)。圖3為透明質(zhì)酸鈉水解物色譜圖，從圖3中可以看出，透明質(zhì)酸鈉的水解產(chǎn)物衍生物的峰位與PMP-氨基葡萄糖衍生物峰位一致。

圖3   透明質(zhì)酸鈉水解物色譜圖

Fig. 3   Chromatograms of hydrolyzed components of sodium hyaluronate

為進一步確認標記組分a為PMP-氨基葡萄糖衍生物，分別收集D-氨基葡萄糖和透明質(zhì)酸鈉對照品水解產(chǎn)物的PMP衍生化溶液，采用C18固相萃取小柱對其富集、脫鹽后進單級四級桿高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀解析。

對標記組分a進行正負離子模式下的單級四級桿高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀掃描分析，圖4為PMP-氨基葡萄糖衍生物質(zhì)譜圖，從圖4中可以看出，在負離子模式下均得到標記組分的分子離子峰質(zhì)荷比均為508.2，在正離子模式下均得到標記組分的分子離子峰質(zhì)荷比均分別為510.2、548.2。

圖4   PMP-氨基葡萄糖衍生物質(zhì)譜圖

Fig. 4   Mass spectrum of PMP glucosamine derivatives

 

圖5為PMP與氨基葡萄糖的反應過程示意圖，用于推測PMP與氨基葡萄糖的反應機理。從圖5中可以看出，衍生物的分子式為C26H31N5O6，分子量為509.5，失去一個氫為[M-H]-(即m/z 508.2)，加氫為[M+H]+(即m/z 510.2)，加鉀離子為[M+K]+(即m/z 548.2)。因此可進一步確證透明質(zhì)酸鈉水解產(chǎn)物之一為氨基葡萄糖。

圖5   PMP與氨基葡萄糖的反應過程示意圖

Fig. 5   Schematic diagram of the reaction process between PMP and glucosamine

2.3 衍生化條件的優(yōu)化

2.3.1 衍生化溫度

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）與透明質(zhì)酸鈉水解后產(chǎn)生的還原性氨基葡萄糖在堿性條件形成PMP-氨基葡萄糖衍生物，該反應需在加熱條件下進行。

分別選擇衍生化在50、60、70、80、90 ℃條件下進行考察溫度對響應值的影響，圖6為不同衍生化溫度對應的色譜峰面積，從圖6中可以看出，該反應從溫度70 ℃起衍生化趨于平穩(wěn)，因此選擇衍生化溫度為70 ℃。

圖6   不同衍生化溫度對應的色譜峰面積

Fig. 6   Chromatographic peak areas corresponding to different derivatization temperatures

2.3.2 衍生化時間

考察70℃條件下加熱時間對響應值的影響，分別選擇衍生化時間為30、60、80、100、120 min進行實驗。圖7為不同衍生化時間對應的色譜峰面積，從圖7中可以看出，PMP-氨基葡萄糖衍生物在80～120 min達到反應平臺期，選擇中間時間點100 min作為衍生化時間。

圖7   不同衍生化時間對應的色譜峰面積

Fig. 7   Chromatographic peak areas corresponding to different derivatization times

2.3.3 萃取溶劑

透明質(zhì)酸鈉水解產(chǎn)物衍生化后，需要用適當溶劑將過量的PMP試劑從水相中萃取分離出去，便檢測分析的同時保證衍生物的穩(wěn)定，過量殘留PMP試劑會引起PMP-氨基葡萄糖衍生物的降解。文獻[11-12,14]多采用氯仿作為萃取溶劑，重復萃取3次后用于檢測分析。氯仿為易制毒管制試劑，改用性質(zhì)相近的二氯甲烷作為萃取溶劑，萃取結(jié)果見表3。由表3可知，采用兩種萃取溶劑的衍生物溶液中PMP經(jīng)3次萃取，萃取量達98%，二氯甲烷與氯仿對過量PMP的萃取能力一致。因此選擇二氯甲烷作為萃取溶劑。

表3   二氯甲烷和氯仿萃取能力

Tab. 3   Extraction ability of dichloromethane and chloroform

 

2.3.4 萃取次數(shù)

在室溫條件下，分別取透明質(zhì)酸鈉對照品溶液、樣品溶液采用二氯甲烷5 mL單次萃取，制備衍生化溶液，分別于0、10、20、30、40、48 h，注入高效液相色譜儀測定，PMP-氨基葡萄糖衍生物的響應值的相對標準偏差低于1%，表明透明質(zhì)酸鈉對照品衍生物和透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料衍生物在室溫條件下放置48 h溶液穩(wěn)定性良好，衍生化溶液中存在少量的PMP試劑并不會導致衍生物降解。因此在衍生化萃取操作中可采用二氯甲烷5 mL單次萃取的方式，快速除去供試品中過量PMP，便于液相色譜分析。

2.4 水解條件的優(yōu)化

2.4.1 酸濃度

透明質(zhì)酸鈉水解產(chǎn)生的氨基葡萄糖在高溫濃酸的環(huán)境下穩(wěn)定，且透明質(zhì)酸鈉對照品與透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料樣品水解程度一致。分別選擇2 mol/L鹽酸、5 mol/L鹽酸、6 mol/L鹽酸進行水解，結(jié)果表明，5 mol/L鹽酸條件和6 mol/L鹽酸條件下，對照品衍生物響應基本一致，2 mol/L鹽酸條件下衍生物對照品響應值偏低，5 mol/L鹽酸條件下透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料樣品加標回收率為98%～102%，說明5 mol/L鹽酸條件透明質(zhì)酸鈉對照品已完全水解并且與透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料樣品的酸水解程度一致。因此選擇最佳鹽酸濃度為5 mol/L。

2.4.2 酸水解時間

考察5 mol/L鹽酸條件下加熱水解時間對PMP-氨基葡萄糖響應值的影響，分別選擇水解時間為0.5、1.5、2.5 h進行實驗。結(jié)果表明，水解時間為0.5 h時衍生物響應值偏低，水解時間為2.5 h時衍生物響應值呈下降趨勢，因此選擇最佳水解時間為1.5 h。

2.5 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗

分別精密量取透明質(zhì)酸鈉對照品溶液、透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料樣品溶液、D-氨基葡萄糖溶液、D-葡萄糖醛酸溶液、空白凝膠溶液、空白試劑溶液各10 μL，在1.2色譜條件下測定。圖8為該專屬性試驗色譜圖，從圖8中可以看出，樣品、對照品衍生化溶液在PMP-氨基葡萄糖衍生物出峰處有相同保留時間，約為23.5 min，空白凝膠對PMP-氨基葡萄糖測定無干擾，D-葡萄糖醛酸衍生物對PMP-氨基葡萄糖測定無干擾。PMP-氨基葡萄糖衍生物色譜峰的理論塔板數(shù)大于35 000，拖尾因子為1.0，與相鄰峰分離度大于1.5。

圖8   專屬性試驗色譜圖

Fig. 8   Chromatogram of specificity test

 

2.6 線性關系和檢測限

分別將透明質(zhì)酸鈉對照品儲備液逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為20、30、40、50、60 μg/mL的透明質(zhì)酸鈉系列標準工作溶液。分別精密量取上述溶液，注入液相色譜儀測定，以透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量濃度為橫坐標，以色譜蜂面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，用最小二乘法進行線性擬合，得到線性方程y=6.531×103x-7.708×103，線性相關系數(shù)為0.999 6。結(jié)果表明，透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量濃度在20～60 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關系良好。以信噪比大于等于3計算透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量分數(shù)，作為方法檢出限，以信噪比大于等于10計算透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量分數(shù)，作為方法定量限。得到透明質(zhì)酸鈉檢出限為0.35 μg/mL，定量限為1 μg/mL。

2.7 精密度試驗

取同一批號透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料進行水解并衍生化，平行配制6份樣品溶液，在1.2色譜條件下測定，記錄峰面積，按透明質(zhì)酸鈉對照計算凝膠敷料中透明質(zhì)酸鈉的含量。精密度試驗結(jié)果見表4。由表4可知，測定均值為2.125 mg/g，測定結(jié)果的相對標準偏差（RSD）為0.5%（n=6），表明該方法的精密度良好。

表4   精密度試驗結(jié)果

Tab. 4   Results of precision test

 

2.8 樣品加標回收試驗

精密稱取空白凝膠1 g，置于20 mL頂空瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為20、40、60 μg/mL透明質(zhì)酸鈉溶液，每個濃度平行配制3份，水解和衍生化后測定，加標回收試驗結(jié)果見表5。由表5可知，平均加標回收率為98.47%（n=9），表明該方法準確可靠，可用于透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料中透明質(zhì)酸鈉含量測定。

表5   樣品加標回收試驗結(jié)果

Tab. 5   Results of recovery test of spiked samples

 

2.9 耐用性試驗

分別考察同規(guī)格不同品牌色譜柱（Thermo ODS-2 C18柱、菲羅門Titank C18柱、Kromasil-100-5 C18柱）、不同柱溫（±3 ℃）、波長（±2 nm）、流動相緩沖鹽濃度（±10%）、流動相pH（±0.2）條件下對檢測結(jié)果的影響。不同條件下PMP-氨基葡萄糖衍生物與相鄰雜質(zhì)峰分離度均符合要求，樣品測定結(jié)果無明顯差異，該方法耐用性良好。

 

3、 結(jié)語

 

通過酸水解、柱前衍生化的前處理方法的選擇、分析條件的優(yōu)化，最終建立了透明質(zhì)酸鈉凝膠敷料中透明質(zhì)酸鈉的檢測方法。該方法專屬性強，靈敏度高，應用范圍廣，可以滿足復雜基體凝膠產(chǎn)品中的透明質(zhì)酸鈉的檢測要求，為透明質(zhì)酸鈉各類制劑的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

 

 

 

參考文獻：

 

1 張志舟，林嘉婷，潘燦盛，等.乙醇沉淀結(jié)合酶解—高效液相色譜法測定固體飲料中透明質(zhì)酸鈉［J］.食品與機械，2023，39（5）：64.

    ZHANG Zhizhou，LIN Jiating，PAN Cansheng，et al. Optimization of extraction technology and determination of sodium hyaluronate in solid drinks by ethanol precipitation combined with enzymatic hydrolysis-reversed phase chromatography［J］.Food & Machinery，2023，39（5）：64.

 

2 王勝男，宮建輝，徐熙明，等.透明質(zhì)酸鈉功能機制及其在食品中的應用進展［J］.食品安全導刊，2022（11）：181.

    WANG Shengnan， GONG Jianhui， XU Ximing，et al. The functional mechanism of sodium hyaluronate and its application in food［J］.China Food Safety Magazine，2022（11）：181.

 

3 蔡同凱，劉謀治，鄧婕，等.透明質(zhì)酸的作用機制及臨床應用研究進展［J］.藥學實踐雜志，2022，40（2）：103.

    CAI Tongkai，LIU Mouzhi，DENG Jie，et al.Research progress on action mechanism and clinical application of hyaluronic acid［J］ Journal of Pharmaceutical Practice，2022，40（2）：103.

 

4 周俊，胡犇，戢力維，等.透明質(zhì)酸鈉可溶微針的制備及性能特征［J］.中國藥業(yè)，2022，31（3）：26.

    ZHOU Jun，HU Ben，JI Liwei，et al. Preparation and property characterization of sodium hyaluronate soluble microneedles［J］. China Pharmaceuticals，2022，31（3）：26.

 

5 常曉丹，王玲艷，郭獨一，等.DPL聯(lián)合注射用透明質(zhì)酸鈉復合溶液在面部年輕化治療中的應用［J］.中國美容醫(yī)學，2024，33（2）：77.

    CHANG Xiaodan，WANG Lingyan，GUO Duyi，et al. Application effect of delicate pulse light combined with sodium hyaluronate composite solution for injection in facial rejuvenation treatment［J］.Chinese Journal of Aesthetic Medicine，2024，33（2）：77.

 

6 朱吉，王娜，耿袁，等.一種有效測量游離透明質(zhì)酸鈉含量的方法［J］.江西化工，2024，40（1）：23.

    ZHU Ji，WANG Na，GENG Yuan，et al. An effective method for measuring the content of free sodium hyaluronate［J］ Jiangxi Chemical Industry，2024，40（1）：23.

 

7 朱鴻達，張松艷，陳自猷.高效陰離子離子色譜-脈沖安培法測定食品中透明質(zhì)酸鈉含量［J］.化工管理，2023，（15）：47.

    ZHU Hongda，ZHANG Songyan，CHEN Ziyou.Determination of sodium hyaluronate in food by high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection［J］. Chemical Engineering Management，2023，（15）：47.

 

8 陳玉娟，陳雯雯，喬莉蘋，等.高效液相色譜法測定透明質(zhì)酸鈉含量的研究［J］.藥學研究，2020，39（3）：146.

    CHEN Yujuan，CHEN Wenwen，QIAO Liping，et al.Determination of sodium hyaluronate by HPLC［J］. Journal of Pharmaceutical Research，2020，39（3）：146.

 

9 張莉，趙鵬，何濤，等.高效凝膠色譜法同時測定眼用粘彈劑中透明質(zhì)酸鈉和硫酸軟骨素鈉的含量［J］.理化檢驗（化學分冊），2018，54（3）：4.

    ZHANG Li，ZHAO Peng，HE Tao，et al. Simultaneous determination of sodium hyaluronate and sodium chondroitin sulfate in eye viscoelastic agents by high performance gel chromatography［J］. Physical Testing and Chemical Analysis（Part B：Chemical Analysis） ，2018，54（3）：4.

 

10 鞏婉秋，王靜怡，朱雨，等.透明質(zhì)酸鈉含量近紅外檢測方法研究［J］.中國檢驗檢測，2023，31（5）：33.

    GONG Wanqiu，WANG Jingyi，ZHU Yu，et al. Research on near-infrared detection method for sodium hyaluronate content［J］. Chinese Journal of Inspection and Testing，2023，31（5）：33.

 

11 黃芳，鄧欣，王玉芹，等.酸水解-柱前衍生化-高效液相色譜法測定面膜化妝品中透明質(zhì)酸［J］.理化檢驗（化學分冊），2019，55（8）：898.

    HUANG Fang，DENG Xin，WANG Yuqin，et al. Determination of hyaluronic acid in facial mask cosmetics by acid hydrolysis pre column derivatization high performance liquid chromatography［J］. Physical Testing and Chemical Analysis（Part B：Chemical Analysis） ，2019，55（8）：898.

 

12 曹辰辰，鄭昕，SUN-WATERHOUSE Dongxiao等.同時測定軟骨酶解物中硫酸軟骨素及透明質(zhì)酸含量的高效液相色譜法的建立［J］.現(xiàn)代食品科技，2023，39（5）：281.

    CAO Chenchen，ZHENG Xin，SUN-WATERHOUSE Dongxiao ，et al. Establishment of high performance liquid chromatography for determination of chondroitin sulfate and hyaluronic acid in cartilage hydrolysate［J］. Modern Food Science and Technology，2023，39（5）：281.

 

13 張璐瑤，趙峽，陳歡歡.糖類化合物PMP衍生分析進展［J］.分析測試學報，2016，35（3）：6.

    ZHANG Luyao，ZHAO Xia，CHEN Huanhuan. Advance in 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone（PMP）derivatization analysis of carbohydrates［J］ Journal of Instrumental Analysis，2016，35（3）：6.

 

14 祝賀.高效液相色譜鑒別糖胺聚糖種類方法的建立及其應用［D］.山東：中國海洋大學，2014.

    ZHU He.A method to distinguish glycosaminoglycans by high performance liquid chromatography and its applications［D］. Shandong：China Ocean University，2014.

 

15 張萍，王仲孚，黃琳娟.糖類物質(zhì)的衍生化試劑—氘代PMP和類似物的合成及其衍生化性能［J］.合成化學，2013，21（3）：262.

    ZHANG Ping，WANG Zhongfu，HUANG Linjuan.Saccharide's Derivatization Reagent—Synthesis and derivatization performances of deuterium PMP and its analogues ［J］.Chinese Journal of Synthetic Chemistry，2013，21（3）：262.

 

16 黃春躍，楊子璇，孫宜春，等.基于PMP柱前衍生化-HPLC法的淫羊藿多糖的單糖指紋圖譜研究［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志， 2024，55（1）：81.

    HUANG Chunyue， YANG Zixuan， SUN Yichun，et al. Monosaccharide fingerprint of epimedium polysaccharides based on PMP pre-column derivatization and HPLC method［J］ Chinese Journal of Pharmaceuticals， 2024，55（1）：81.

 

17 劉永玲，趙建國，趙治兵，等.PMP柱前衍生HPLC法測定八月瓜果皮多糖中單糖組成［J］.食品研究與開發(fā)，2023，44（21）：131.

    LIU Yongling，ZHAO Jianguo，ZHAO Zhibing，et al. Determination of monosaccharide composition of polysaccharides from akebia trifoliate peel by PMP-HPLC with pre-column derivatization［J］. Food Research and Development，2023，44（21）：131.

 

18 孫紅梅，李明華，程顯隆，等.柱前衍生化高效液相色譜法測定麥冬中多糖的含量［J］.中國現(xiàn)代中藥，2022，24（11）：2 126.

    SUN Hongmei， LI Minghua， CHENG Xianlong，et al.，Determination of polysaccharides in ophiopogon japonicus by pre-column derivatization high-performance liquid chroma-tography［J］.Modern Chinese Medicine，2022，24（11）：2 126.