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雜質(zhì)研究之基毒雜質(zhì)研究與檢測(cè)

嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-09-09 12:12

基因毒性雜質(zhì)(Genotoxic Impurity，GTI)：是指能直接或間接損傷細(xì)胞DNA，產(chǎn)生致突變和致癌作用的物質(zhì)。

潛在基因毒性雜質(zhì)(Potential Genotoxic Impurity，PGI )：是指具有警示結(jié)構(gòu)，但尚未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有遺傳毒性的雜質(zhì)。

此處，咱們簡(jiǎn)單延伸說(shuō)下基毒雜質(zhì)是如何損傷DNA，導(dǎo)致突變和致癌的。

首先基毒雜質(zhì)的作用對(duì)象是DNA，即脫氧核糖核酸。它帶有合成RNA和蛋白質(zhì)所必需的遺傳信息，是生物體發(fā)育和正常運(yùn)作必不可少的生物大分子。

DNA 分子結(jié)構(gòu)中，兩條多脫氧核苷酸鏈圍繞一個(gè)共同的中心軸盤繞，構(gòu)成雙螺旋結(jié)構(gòu)。脫氧核糖-磷酸鏈在螺旋結(jié)構(gòu)的外面，堿基朝向里面。兩條多脫氧核苷酸鏈反向互補(bǔ)，通過(guò)堿基間的氫鍵形成的堿基配對(duì)相連，形成相當(dāng)穩(wěn)定的組合。如下圖：

脫氧核苷酸由堿基、脫氧核糖和磷酸構(gòu)成。其中堿基有4種：腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。四個(gè)堿基中有很多的親核位點(diǎn)，比如嘧啶環(huán)和嘌呤上的N和O等，這些位點(diǎn)可以與親電試劑（如烷基化試劑、?；噭┑龋┓磻?yīng)而產(chǎn)生不可逆的變化，從而引起基因突變。以鳥嘌呤為例，結(jié)構(gòu)見下圖：

事實(shí)上，DNA的反應(yīng)種類除了只反應(yīng)某一處位點(diǎn)外，還會(huì)有一些比較復(fù)雜的反應(yīng)類型：

有的堿基上不僅含有一個(gè)親核位點(diǎn)，如果一個(gè)致癌物有兩處親電位點(diǎn)，反應(yīng)一處后，還會(huì)和堿基的另外一個(gè)位點(diǎn)反應(yīng)，生成一些小環(huán)。

雙親電基團(tuán)的另外一個(gè)基團(tuán)也有可能和兩個(gè)不同的堿基鏈接，甚至可以和兩個(gè)螺旋上的不同堿基鏈接。

另外，DNA的反應(yīng)活性除了親核性之外，主要還受空間結(jié)構(gòu)的影響。

2、基毒雜質(zhì)的來(lái)源

基因毒性雜質(zhì)主要來(lái)源于原料藥合成過(guò)程中的起始物料、中間體、試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物。此外，藥物在合成、儲(chǔ)存或者制劑過(guò)程中也可能會(huì)降解產(chǎn)生基因毒性雜質(zhì)。

3、基毒雜質(zhì)的分類

參考ICH M7，它將基毒雜質(zhì)根據(jù)不同的控制措施分為了以下五大類。

結(jié)合這個(gè)分類補(bǔ)充說(shuō)明的兩點(diǎn)就是：1）具有誘變性，不一定會(huì)致癌；2）具有警示結(jié)構(gòu)，不一定具有誘變性。因此，通常1、2類是根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)確認(rèn)，而3、4、5類則根據(jù)科學(xué)的定量構(gòu)效關(guān)系（Q）SAR或Ames細(xì)菌試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)。

4、基毒雜質(zhì)的評(píng)估

目前基毒雜質(zhì)的評(píng)估，主要采用兩個(gè)互補(bǔ)的(Q)SAR 預(yù)測(cè)方法。一個(gè)方法基于專家知識(shí)規(guī)則，另一個(gè)方法基于統(tǒng)計(jì)學(xué)。

如果經(jīng)兩種互補(bǔ)的(Q)SAR方法預(yù)測(cè)均沒(méi)有警示結(jié)構(gòu)，則足以得出該雜質(zhì)沒(méi)有致突變性擔(dān)憂的結(jié)論，可不做進(jìn)一步的檢測(cè)，歸為第5類雜質(zhì)。

基于專家知識(shí)規(guī)則的方法：規(guī)則來(lái)源于專家系統(tǒng)的知識(shí)和毒理學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果，如DEREK。

基于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：由一組化合物的生物學(xué)和毒理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析預(yù)測(cè)，建立模型，再自動(dòng)生成化學(xué)結(jié)構(gòu)及所引發(fā)毒性作用的量化關(guān)系，預(yù)測(cè)待測(cè)物毒性。如Sarah Nexus。

5、基毒雜質(zhì)的控制策略

基毒雜質(zhì)的控制的基本策略是A-C-E（Avoid-Control-Expel），即避免基毒雜質(zhì)生成、控制基毒產(chǎn)生和將基毒清除出產(chǎn)物。

1、通過(guò)改變?cè)稀⒃噭┘巴读享樞蚩梢员苊馍苫倦s質(zhì)；

2、通過(guò)反應(yīng)機(jī)理的研究（如溫度、時(shí)間、pH等）可以控制基毒雜質(zhì)的生成；

3、通過(guò)后處理（如萃取、結(jié)晶、干燥等）可以去除已生成的基毒雜質(zhì)。

在ICH M7中主要列舉了以下四種控制策略：

原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中控制在可接受限度以下，即終點(diǎn)控制。

起始物料或中間體標(biāo)準(zhǔn)或中控過(guò)程中控制在可接受限度以下，即原料或過(guò)程控制。

起始物料或中間體標(biāo)準(zhǔn)或中控過(guò)程中控制在可接受限度以上，明確雜質(zhì)去向，結(jié)合加標(biāo)試驗(yàn)的清除率，確保在成品中殘留量小于可接受限度的30%以下。

充分理解工藝參數(shù)和影響雜質(zhì)殘留因素，能確保在成品原料藥中的殘留在可接受限度以下，無(wú)需檢測(cè)，也不訂入任何標(biāo)準(zhǔn)。如基于理化性質(zhì)（反應(yīng)活性，溶解性、揮發(fā)性等）的分析。

6、基毒雜質(zhì)的控制方法

雜質(zhì)控制的目的是為了保障患者的安全。同時(shí)雜質(zhì)的毒性是與劑量息息相關(guān)的，基毒雜質(zhì)也不例外。由于生物系統(tǒng)存在自我修復(fù)和糾正的功能，使得我們無(wú)法直接通過(guò)試驗(yàn)（如劑量從低到高，對(duì)其影響性進(jìn)行線性推斷）獲得某個(gè)雜質(zhì)的毒性閾值。

因此，對(duì)于基毒雜質(zhì)的控制需要確定一個(gè)可接受其風(fēng)險(xiǎn)的攝入量------毒理學(xué)關(guān)注閾值（Threshold of Toxicological Concern，TTC）

TTC的定義是針對(duì)所有化學(xué)物質(zhì)的一個(gè)暴露水平，當(dāng)?shù)陀谠撍綍r(shí)，無(wú)論是否獲得化學(xué)特異性的毒性數(shù)據(jù)，在終生服用的情況下對(duì)人體健康都不會(huì)產(chǎn)生明顯的危害。換句話說(shuō)就是每天攝入1.5微克的基因毒性雜質(zhì)，被認(rèn)為對(duì)于大多數(shù)藥品來(lái)說(shuō)是可以接受的風(fēng)險(xiǎn)。因?yàn)樗沟萌艘簧闹掳╋L(fēng)險(xiǎn)小于十萬(wàn)分之一。而現(xiàn)實(shí)生活中，人一生得癌癥的概率是四分之一。

對(duì)于TTC，我們需要說(shuō)明的是：

1）TTC它是一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)管理工具，采用的是概率的方法，不能被理解為是絕對(duì)無(wú)風(fēng)險(xiǎn)的保障。

2）致癌性明確的雜質(zhì)需進(jìn)行特殊的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，TTC 法并不適用。有幾個(gè)結(jié)構(gòu)基團(tuán)被認(rèn)定為具有非常高的基因毒性，它們即使被攝入低于TTC值的量也會(huì)面臨非常高的基因毒性風(fēng)險(xiǎn)。如黃曲霉毒素類、N-亞硝胺類、烷基偶氮化合物類等。

3）結(jié)構(gòu)不同的單個(gè)雜質(zhì)的限度應(yīng)該小于1.5微克/天。有相同作用機(jī)制、結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)，其含量總和的限度仍應(yīng)該參考1.5微克/天的限量進(jìn)行評(píng)估（見表2）。而多個(gè)作用機(jī)制不同的基因毒性雜質(zhì)可攝入總量則可應(yīng)參考表3。