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正確的實驗設(shè)計對完成整個實驗十分重要，接下來我以研究某腫瘤為例，分享實驗設(shè)計的基本原則及經(jīng)驗。

1.在開始選題前，大量閱讀行業(yè)高分論文，明確已發(fā)表的成果、已研究的方向，避免進行重復(fù)無效的研究。

2.和導(dǎo)師具體商定最后的選題，對于腫瘤來說，一般方向為某基因?qū)δ衬[瘤進展過程影響的研究，但對于基因的選擇，一般由課題組前期研究結(jié)果、導(dǎo)師或生信分析而來。

3.研究基因確定后，可開始進行實驗，同時需要考慮最后的大論文題，可邊做邊逐步縮小題目范圍。

4.整體實驗設(shè)計為：

選題確定后可著手買試劑、設(shè)計引物等，可多閱讀一些文獻，在能力范圍內(nèi)選擇較好的試劑。

實驗之初選取腫瘤細胞系4-6種，通過Wb和qpcr分別驗證基因在細胞系中的表達情況，后續(xù)實驗選擇基因表達較高及較低兩個細胞系，高表達的后續(xù)做基因敲減，低表達的做基因過表達。

細胞表型實驗：運用兩種細胞系分別做表型實驗，細胞常規(guī)表型包括細胞增殖（cck8、細胞活力、MTT、細胞克隆形成、細胞計數(shù)等）、細胞侵襲（Transwell實驗、Boyden實驗等）及細胞遷移（細胞劃痕實驗、傷口愈合實驗等）。

注意：細胞表型是實驗剛開始的部分，若敲減或過表達某種基因使細胞的表型發(fā)生非常明顯發(fā)變化，可著手一邊繼續(xù)驗證表型，一邊送三方公司測序，減少后期等待時間。

細胞敲減及過表達均有瞬時敲減/過表達及穩(wěn)定敲減及過表達，為減少后續(xù)實驗的時間，省去瞬時敲減繁瑣的流程，應(yīng)同時準備構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。

在完成常規(guī)的細胞表型實驗后，詳細分析測序結(jié)果，從中尋找可能引起上述細胞表型的機制。同時，也可根據(jù)測序結(jié)果繼續(xù)驗證表型，如測序結(jié)果和細胞周期基因相關(guān)，可以通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化，也可通過Wb檢測周期相關(guān)蛋白變化。

引起腫瘤細胞發(fā)生變化的機制數(shù)不勝數(shù)，每一個課題所能研究出的結(jié)果都較為表面，可根據(jù)測序結(jié)果，推測可能機制，或可能和哪條信號通路相關(guān)，然后進行機制相關(guān)驗證，保證研究內(nèi)容形成閉環(huán)。

5.一些建議：

關(guān)于初期的表型驗證：不能以一次實驗結(jié)果作為最后的結(jié)果，若第一次驗證表型無明顯變化，先檢查實驗流程、試劑、實驗操作有無問題，不能以一次結(jié)果否定整個課題。當然若表型驗證實在沒有變化，及時和導(dǎo)師討論更改課題。

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株有很多種方法可以實現(xiàn)，選擇熟悉的方法即可。

所有實驗的原始記錄一定要保存好，即使是無意義的結(jié)果。