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清潔驗(yàn)證的目的是為了證明清潔程序的高效性與一致性。選擇產(chǎn)品殘留、清潔劑、微生物污染，以及其他任何工藝成分的限度，邏輯上應(yīng)該基于物料對(duì)生產(chǎn)流程和產(chǎn)品的安全性和純度的影響而定。清潔生產(chǎn)系統(tǒng)和成分的可接受限度應(yīng)該“切合實(shí)際、可達(dá)到、可證實(shí)”。

清潔驗(yàn)證的限度一般包含與活性蛋白 （或者其他的主要物質(zhì)成分） 相關(guān)分析、與清潔劑相關(guān)的分析、與生物負(fù)載水平相關(guān)的分析、與內(nèi)毒素水平相關(guān)的分析，以及設(shè)備目檢清潔要求。另外，如果存在任何與活性蛋白或者其他工藝組分相關(guān)的特別毒性物質(zhì)（例如細(xì)胞毒性、變應(yīng)原性、或者生殖危害物），那么生產(chǎn)商的毒理學(xué)或生理學(xué)團(tuán)隊(duì)就需要確定是否有必要改變限度，或者是否需要使用專用的設(shè)備。在接下來(lái)的討論中，限度的考慮應(yīng)該基于自然殘留和生產(chǎn)的各個(gè)階段（例如，原液 vs.配制/分裝）。生產(chǎn)階段包括主要原液生產(chǎn)（所有的步驟是為了獲取活性藥物）和配制/分裝（將原液加入到成品的制劑以及藥品物質(zhì)的初級(jí)包裝）。原液的生產(chǎn)進(jìn)一步分為上游生產(chǎn)步驟（收獲藥物前的所有步驟）和下游生產(chǎn)步驟（藥物純化以及后續(xù)步驟）。

1、活性物限度的關(guān)鍵問(wèn)題

生物技術(shù)的清潔過(guò)程經(jīng)常涉及到活性分子本身的改變，因?yàn)檫@些活性物質(zhì)通常是蛋白質(zhì)。在生物制品制造通常應(yīng)用的清潔過(guò)程中，蛋白質(zhì)都會(huì)在一定程度上發(fā)生降解。下面就總結(jié)一下最主要的降解機(jī)制。在堿性溶液中，尤其是高溫，溶液中含有氫氧化鈉和氫氧化鉀，蛋白質(zhì)就會(huì)水解成可溶的寡聚物或者自由氨基酸?；钚晕镔|(zhì)上的酯基團(tuán)水解為一個(gè)醇和一個(gè)脂肪酸，一個(gè)最為普遍的例子就是將脂肪和油脂轉(zhuǎn)化為甘油和脂肪酸的皂化反應(yīng)。次氯酸鈉有時(shí)會(huì)用于生物技術(shù)清潔， 作為一種清潔劑， 它能非常有效地從表面去除變性蛋白質(zhì)殘留。

它是一種活潑的氧化劑，它能夠使蛋白質(zhì)更隨機(jī)地降解為更小的片段。使用次氯酸鈉時(shí)通常關(guān)注其對(duì)不銹鋼成分的危害作用。因此， 關(guān)鍵的是，使用次氯酸鈉后的漂洗循環(huán)能將氯離子殘留沖洗干凈，然后再進(jìn)行酸清潔。在高 pH 下蛋白會(huì)水解，控制時(shí)間和溫度參數(shù)都會(huì)在很大程度上影響蛋白質(zhì)的水解。因此，pH 和溫度越高，蛋白就越容易發(fā)生水解。因?yàn)榈鞍淄ǔ＝到鉃楦鼮樾〉钠?，這些小片段趨向于高度極化，他們更加易于溶于水，也更加容易通過(guò)清潔、漂洗的過(guò)程從設(shè)備表面去除。蛋白質(zhì)暴露于高 pH 的第二個(gè)效果就是，水解導(dǎo)致其生物學(xué)活性的下降可能是一個(gè)不可逆的、顯著的過(guò)程。

活性物的降解可以在實(shí)驗(yàn)室中驗(yàn)證，通過(guò)將活性物質(zhì)暴露在模擬清潔條件（或者強(qiáng)度更低的條件）的清潔溶液中，然后對(duì)生成的混合物進(jìn)行分析和/或者生物化學(xué)的測(cè)試?；谶@些原因，在大多數(shù)情況下生物技術(shù)制造商在清潔驗(yàn)證流程中并不直接設(shè)置活性限度，或者直接檢測(cè)活性。由于活性物質(zhì)的降解，在清潔過(guò)程完成后，應(yīng)該不會(huì)有活性物質(zhì)的殘留。正是出于這個(gè)原因，人們用像 TOC{總有機(jī)碳（Total organic carbon）}的分析方法檢測(cè)蛋白質(zhì)的殘留物 （或片段）。如像 TOC 的非特異性的方法被用于活性物質(zhì)殘留的檢測(cè)等相關(guān)使用， 應(yīng)該指出，清潔后真正的蛋白質(zhì)殘留是非常低的，因?yàn)?TOC 檢測(cè)的是所有的有機(jī)碳源（并不僅僅是來(lái)源于活性蛋白的殘余）。

1.1 在制劑和最終分裝中建立活性物限度

在生物技術(shù)產(chǎn)品的制劑和分裝生產(chǎn)中，蛋白質(zhì)活性限度的設(shè)定是用污染(傳遞)量計(jì)算(通常稱為MAC，或最大可允許的傳遞量)，跟小分子清潔驗(yàn)證使用同樣的方法。雖然產(chǎn)品降解(如上所述)，計(jì)算是基于活性產(chǎn)品的量。如果在制劑/分裝所用的清潔方法導(dǎo)致了活性蛋白降解為小分子片段， 該方法就代表了最差的情況。考慮到降解作用，這個(gè)計(jì)算可以進(jìn)行修正。只有當(dāng)每日治療劑量是已知的，才能應(yīng)用這種方法。對(duì)于長(zhǎng)期使用的產(chǎn)品，一個(gè)典型的方法是，在隨后制造最大活性日治療劑量的產(chǎn)品中，允許其攜帶不超過(guò)最小活性日治療劑量的 1/1000；1/1000的因子可能根據(jù)特殊情況而修訂。此外，如果計(jì)算允許在隨后的藥物產(chǎn)品中活性蛋白殘留量超過(guò)10ppm，可以使用在下一批次的藥物產(chǎn)品中，10 ppm 活性藥物蛋白的限度。類似的標(biāo)準(zhǔn)在包括美國(guó)FDA(8)和 PIC/S 的指導(dǎo)文件中是有例子的。

然后單位面積的限度可以基于下一個(gè)最小批量的藥物生產(chǎn)所共用的設(shè)備面積上計(jì)算出來(lái)。擦拭或沖洗樣品中的限度可以通過(guò)采樣的參數(shù)計(jì)算出來(lái)。當(dāng)使用這個(gè)方法設(shè)定限度時(shí)，活性物的限制可以計(jì)算出來(lái)。然后它可以轉(zhuǎn)換為分析方法適當(dāng)?shù)膯挝欢焕谩＠?，如果分析方法?TOC，活性物質(zhì)的限度可以通過(guò)轉(zhuǎn)換為 TOC，即基于 TOC 在活性物質(zhì)的含量（百分比）而計(jì)算出來(lái)。

應(yīng)該指出的是，基于污染量（傳遞量）計(jì)算的限度是設(shè)置限度的“科學(xué)根據(jù)的”方法之一。一些公司選擇基于更嚴(yán)厲的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定限度，例如用 WFI TOC 值 500ppb 作為標(biāo)準(zhǔn)。雖然這種方式是可以接受的，但是只有證明 WFI TOC 標(biāo)準(zhǔn)要比污染量計(jì)算的 TOC 結(jié)果更加嚴(yán)格，才可以使用這種方法。

1.2 在原液生產(chǎn)中建立的活性物限度

用于制劑/分裝的污染量計(jì)算通常不適用于原液的生產(chǎn)。主要的原因是如果污染量計(jì)算的方法是基于整個(gè)生產(chǎn)線的設(shè)備表面積，限度是極低的，除非藥物活性成分在清潔過(guò)程中不會(huì)降解，否則是不能用現(xiàn)行分析技術(shù)測(cè)量的。

正如前面討論的，活性蛋白在大多數(shù)情況下，都會(huì)在清潔過(guò)程中被降解。因此，即使典型的特異性方法可以在很低水平上測(cè)量活性物質(zhì)，但是當(dāng)活性分子降解后這些方法是不能使用的。

如上所述，活性物的殘留一般都是像 TOC 一樣通過(guò)“間接”測(cè)量某一特性（為了這個(gè)報(bào)告的目的，TOC 將作為此類分析方法的例子，盡管也可以用總蛋白測(cè)量之類的方法）。

通常清潔驗(yàn)證 TOC 的定量限度大約為 100-500 ppb 碳，與含碳量為 50%的約 200-1000 ppb 蛋白質(zhì)的數(shù)值等效。因此說(shuō)如果限度是基于整個(gè)設(shè)備鏈的表面積而計(jì)算污染量的，那么 TOC 是不能用作分析方法的。一些公司選擇使用一些限制區(qū)域的表面積計(jì)算污染量，例如使用最后一個(gè)生產(chǎn)罐或用最后一步純化工藝后的所有生產(chǎn)設(shè)備。這樣的修訂也許會(huì)導(dǎo)致計(jì)算的污染量，可以用 TOC 測(cè)定。這種方法的原理可以在 ICH Q7（藥物活性成分的 GMP 指南）中找到；在指南的 12.7 章節(jié)中提到如果在隨后的生產(chǎn)步驟中去除這些殘留物，在早期的生產(chǎn)步驟中不需要驗(yàn)證。發(fā)酵和處理后的各種工藝步驟，包括層析純化及超濾等，預(yù)期可以去除早期清潔過(guò)程中所留下的殘留物，因?yàn)檫@些殘留物通常是小分子片段。這一點(diǎn)對(duì)于一個(gè)特定的活性物還沒(méi)有被證實(shí)，而是根據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)降解的理解以及生產(chǎn)工藝中所使用的各個(gè)純化工序的了解，所做的一個(gè)合理假定。在污染量計(jì)算的依據(jù)中，應(yīng)考慮活性蛋白的滅活。這將導(dǎo)致一個(gè)保守的限度，因?yàn)樗俣ń到馑槠乃幚韺W(xué)作用和/或安全考慮是遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于天然蛋白質(zhì)的。

由于這些測(cè)量問(wèn)題，也由于降解的問(wèn)題，一個(gè)更普遍的設(shè)定活性物殘留限度的技術(shù)是基于工藝能力。這不是一個(gè)真正的工藝能力研究，而是基于在生物產(chǎn)品制造中已有的和傳統(tǒng)的清潔操作程序來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這些限度通?；谒袠悠返?TOC 值，不論是沖洗或擦拭。作為一般規(guī)則，那些純化工藝后的限度應(yīng)更加嚴(yán)格。上游工藝的 TOC 限度通常會(huì)嚴(yán)格性差一些，因?yàn)樵O(shè)備表面清潔的產(chǎn)品會(huì)有更多外來(lái)材料的（例如細(xì)胞物質(zhì)）。

可接受標(biāo)準(zhǔn)通常為下游工藝 TOC 1-2ppm 和上游工藝 TOC5-10ppm。就像其他清潔驗(yàn)證方案一樣，應(yīng)該注意，通常獲得的數(shù)值應(yīng)顯著低于既定的限度。但是對(duì)于如超濾膜和色譜樹(shù)脂這些產(chǎn)品專用材料來(lái)說(shuō)是可以有例外的。這些都是下游工藝的一部分，但是可以設(shè)定更高的限度值。當(dāng)這些對(duì)象只是專門用于制造一種產(chǎn)品時(shí)，更高水平的限度是可以接受的。

1.3 基于毒理學(xué)的限度

一種為制劑/分裝或者原液生產(chǎn)而建立活性物限度的替代方法，是基于毒理學(xué)計(jì)算而建立的限度。這些活性物的毒理學(xué)計(jì)算與在下文第二部分第一小節(jié)市售化學(xué)試劑的限度中所提到的清潔劑毒理學(xué)計(jì)算是類似的。毒理學(xué)計(jì)算通常涉及活性物質(zhì)短期的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，最后到達(dá)一個(gè) ADI（允許的日攝入量）。基于同一種用藥途徑（如果是注射給藥的產(chǎn)品應(yīng)通過(guò)靜脈注射來(lái)研究）的毒理學(xué)數(shù)據(jù)計(jì)算會(huì)更好。如果數(shù)據(jù)是基于口服的毒理學(xué)，對(duì)注射藥的清潔應(yīng)要求增加安全系數(shù)。作為一個(gè)總的看法，這種基于對(duì)安全考慮而進(jìn)行的計(jì)算，與基于劑量的計(jì)算相比，通常會(huì)導(dǎo)致較高的限度。此外，如果活性蛋白降解，更多的相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)不是天然蛋白質(zhì)的毒理學(xué)，而是降解碎片的毒理學(xué)，通常認(rèn)為后者安全問(wèn)題更少（雖然通常不會(huì)進(jìn)行降解碎片的毒性研究）。

2、清潔劑的限度

清潔劑的限度也取決于生產(chǎn)的各個(gè)階段（制劑/分裝與原液生產(chǎn)）。典型的生物制藥清潔程序包括強(qiáng)堿清洗以及下一步的磷酸物的清洗，或者是堿性清潔劑以及隨后的酸性清潔劑。這些過(guò)程都是分開(kāi)處理的。

2.1 市售化學(xué)試劑的限度

如果只有市售化學(xué)試劑如氫氧化鈉和磷酸用于清潔，那么通常的做法是用電導(dǎo)率的值為其設(shè)定間接的限度。更好的做法是，氫氧化鈉或者磷酸的可接受水平建立在毒理學(xué)的污染量計(jì)算或者是工藝參數(shù)的效果之上。然后電導(dǎo)率限度的設(shè)定水平就等同于在特定溫度下的那個(gè)濃度。這種情況下用這種方法設(shè)置電導(dǎo)率的限度，通常要好于在相同溫度下注射用水的電導(dǎo)率限度。因此，限度是基于注射用水的標(biāo)準(zhǔn)或者是稍高于這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（例如 5 μS/cm）。這種做法的原因是它要比“科學(xué)”計(jì)算的限定值更加嚴(yán)格。此外，在許多情況下，磷離子/或鈉離子可能是隨后制造出來(lái)產(chǎn)品的一部分。因此，少量的污染量并不明顯。

還應(yīng)指出的是，基于市售化學(xué)試劑的毒性計(jì)算是比較極端的，因?yàn)闅溲趸c并不會(huì)以氫氧化鈉的形式污染到最終的產(chǎn)品中，磷酸也不會(huì)以磷酸的形式污染到最終產(chǎn)品的。如果這些化學(xué)物質(zhì)以高濃度完整地污染下來(lái)，通過(guò)工藝檢查（這樣會(huì)引起 PH 的顯著變化）也會(huì)發(fā)現(xiàn)這種不符合性。因此，目標(biāo)并不要求與注射用水的標(biāo)準(zhǔn)一致，而是確認(rèn)一個(gè)很低的清潔劑含量。而允許電導(dǎo)率限度略高于注射用水限度的原因是，注射用水的限度要求只是適用于管路中的循環(huán)注射用水。一旦從循環(huán)管路中取出水并通過(guò)清潔設(shè)備（尤其是通過(guò)噴淋裝置時(shí)它可以從空氣中攝取二氧化碳），不要期望它一定會(huì)滿足 WFI 的電導(dǎo)率限度。

2.2 處方清潔劑的限度

對(duì)于制劑/分裝制造，處方清潔劑（可能在無(wú)機(jī)氫氧化物中添加很多有機(jī)組分）殘留量的限度通常是依據(jù)其短期毒性（LD50）數(shù)據(jù)而計(jì)算污染量的。這種毒性資料可提供的清潔劑制造商或可使用的計(jì)算制訂成分分析的基礎(chǔ)上最壞情況的假設(shè)。這種毒理學(xué)的資料可由制造商提供或使用基于處方成分分析得出的最差情況而計(jì)算。為了確定下一個(gè)藥物產(chǎn)品中的限度值，如果處方清潔劑的默認(rèn)值比污染量計(jì)算的值更加嚴(yán)格，也可以采用。

處方清潔劑的默認(rèn)值一般為 10ppm。請(qǐng)注意活性物污染量計(jì)算與處方清潔劑污染量計(jì)算的差異在于對(duì)后續(xù)產(chǎn)品的污染限度計(jì)算方法不同，一個(gè)使用的是劑量比率，而另一個(gè)用的是半致死率 LD50 比率。一旦完成計(jì)算，隨后的清潔劑計(jì)算使用與活性物同樣的公式，來(lái)確定每個(gè)拭子或每個(gè)分析樣品的限度。

對(duì)于原液生產(chǎn)，為活性物限度而討論的一些問(wèn)題也同樣適用于清潔劑。也就是說(shuō)，考慮到整個(gè)共享面積的污染量計(jì)算值是極低的，通常難以測(cè)量。但是，使用的處方洗滌劑通常在分離提純等過(guò)程中可根據(jù)分子量去除（例如超濾或者是分子排阻色譜法）。就像活性成分的限度一樣，毒性計(jì)算可能適用于下游純化后的步驟或下游工藝的最后一個(gè)容器。

3、微生物限度

考慮到清潔后微生物的限度，不要預(yù)期清潔過(guò)程本身會(huì)導(dǎo)致設(shè)備的無(wú)菌結(jié)果。然而，即使如果設(shè)備進(jìn)行在位滅菌或者是在下一產(chǎn)品生產(chǎn)前滅菌，通常的做法是評(píng)估微生物負(fù)載來(lái)確保隨后的生產(chǎn)工藝不會(huì)過(guò)度挑戰(zhàn)。只要達(dá)到一般的非無(wú)菌生產(chǎn)微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（1-2CFU/cm2 表面取樣方法）就已經(jīng)是足夠的。對(duì)于沖洗取樣，一些公司將利用典型 WFI 的值（10 CFU/100 毫升），而其他公司將利用 100CFU/100 毫升或 1,000 CFU/100 毫升的值。設(shè)定較高的限度原因是隨后設(shè)備將進(jìn)行滅菌。此外，WFI的值是在管路中循環(huán)的注射用水值，一旦它從循環(huán)管路中取出并加到設(shè)備中時(shí)，并不要期望它能必然符合原有的注射用水值。

4、內(nèi)毒素限度

在內(nèi)毒素經(jīng)各個(gè)去除步驟后，內(nèi)毒素對(duì)最終產(chǎn)品的污染量是更值得關(guān)注的。在這種情況下，內(nèi)毒素通常只在最后的沖洗水測(cè)定，限度設(shè)定通常是注射用水標(biāo)準(zhǔn) 0.25EU/ml。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的內(nèi)毒素去除步驟之前，沖洗水取樣預(yù)期應(yīng)該符合注射用水限度。對(duì)于用大腸桿菌進(jìn)行的細(xì)菌發(fā)酵（革蘭氏陰性細(xì)菌，在沖洗過(guò)程中能夠生產(chǎn)大量的內(nèi)毒素），在發(fā)酵和收獲步驟后的清洗符合注射用水限度，是不可能完成的，這種情形下，其它公司在更高的水平設(shè)置內(nèi)毒素限度，例如 5-25 EU/mL。實(shí)現(xiàn)這一水平表明清潔工藝得到控制，任何在這種水平上的可能污染量應(yīng)在隨后的內(nèi)毒素清除工序中評(píng)價(jià)。

5、視覺(jué)清潔標(biāo)準(zhǔn)

產(chǎn)品表面的外觀目測(cè)是核實(shí)殘留物去除的一種直接衡量手段。外觀目測(cè)也不是一種定量的方法，但是對(duì)于直接檢查產(chǎn)品表面清潔非常有用。只要有路徑可以到達(dá)關(guān)鍵的表面，外觀目測(cè)很容易完成。它能確認(rèn)生產(chǎn)設(shè)備重要區(qū)域的潔凈程度。文獻(xiàn)表明少量的殘留（如果存在）是可見(jiàn)的和可被察覺(jué)的。如同在生物制藥中所使用的，目測(cè)清潔標(biāo)準(zhǔn)能典型地用做清潔驗(yàn)證方案中的擦拭和/或沖液中殘留物的測(cè)試。

6、修改限度

設(shè)立行動(dòng)和/或警戒限度，作為日常工藝驗(yàn)證監(jiān)測(cè)的一部分。這些值通常比驗(yàn)證方案中的合格/失敗限度更加嚴(yán)格。依據(jù)工藝能力顯示連續(xù)的低水平和維持這些水平的能力，可以進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并考慮為將來(lái)的驗(yàn)證方案采用更加嚴(yán)格的限度。

本文作者劉生巧，甘肅三泰綠色科技有限公司，來(lái)源于現(xiàn)代鹽化工，僅供交流學(xué)習(xí)。