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（一）同樣大小的DNA一起跑電泳，怎么條帶不一樣大？

 

DNA條帶不一樣大，本質(zhì)上是DNA在凝膠中的遷移率不一樣，有的跑得快，有的慢，通常情況同樣大小的DNA，遷移率是一樣的，條帶位置也會(huì)一樣。

 

但遷移率也受很多因素影響，例如DNA的構(gòu)象。例如環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA，和同等大小的線性DNA（例如單位點(diǎn)酶切后的質(zhì)粒），前者的遷移率要高，表現(xiàn)出來就是看上去超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA分子量好像小一點(diǎn)。

 

（二）為什么有時(shí)候加大電泳的電壓，DNA會(huì)跑得快，但有時(shí)效果卻不明顯？

 

在較低電壓時(shí)，提高電壓，DNA的遷移率也會(huì)提高；但如果DNA分子量太大時(shí)，增加電壓后對(duì)DNA遷移率的提高其實(shí)不成比例，說白一點(diǎn)，就是有效果，但不明顯。

 

例如，當(dāng)DNA分子量大于2Kb后，施加在電泳槽兩端的電壓不應(yīng)該高于5V/cm，如果電泳槽長40cm，那么電壓不應(yīng)該高于200V。

 

（三）瓊脂糖質(zhì)量對(duì)電泳效果有多大影響？

 

有時(shí)候，換了一個(gè)批次的瓊脂糖，或者更換了新的供應(yīng)商的瓊脂糖后，同樣的樣品進(jìn)行電泳，效果也會(huì)有差異。

 

最常見的一個(gè)原因在于，瓊脂糖本身的質(zhì)量也是影響電泳結(jié)果的一個(gè)因素。

 

瓊脂糖由大量的多糖組成，這些多糖會(huì)與硫酸鹽吸附，成為一種叫硫酸化多糖的東西。在電泳時(shí)，它會(huì)產(chǎn)生正電荷，并向陰極移動(dòng)，也就是和DNA移動(dòng)的方向相反。

 

最終，DNA移動(dòng)的阻力就增加了。這種現(xiàn)象叫做瓊脂糖的電內(nèi)滲（EEO）。因此，采購低水平電內(nèi)滲的瓊脂糖能有效提高分離效果。

 

（四）電泳緩沖液對(duì)電泳效果有多大影響？

 

電泳時(shí)，電泳緩沖液是一種經(jīng)常需要更換的試劑。

 

最理想的狀態(tài)，應(yīng)該是，使用同一批次的電泳緩沖液母液進(jìn)行1X電泳緩沖液的配置和對(duì)應(yīng)檔次電泳的凝膠配置。因?yàn)橹挥羞@樣操作，才能保證整個(gè)離子緩沖環(huán)境是一致的。

 

有時(shí)我們會(huì)為了圖方便，長期使用一個(gè)批次的1X電泳緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，甚至到了母液都用完了，還在用之前那個(gè)批次的緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這樣就會(huì)影響實(shí)驗(yàn)效果了。

 

另外，常見的電泳緩沖液的使用錯(cuò)誤，還包括，直接倒入自來水替代電泳緩沖液，或者直接使用10X或50X的母液當(dāng)緩沖液進(jìn)行電泳。‘

 

前者因?yàn)榫彌_體系內(nèi)缺乏足夠的離子，造成電導(dǎo)率很低，DNA遷移速度很慢，甚至完全不動(dòng)了；而后者則因?yàn)殡妼?dǎo)率太高，造成整個(gè)緩沖液產(chǎn)熱太厲害，甚至連凝膠都融化了。

 

（五）低熔點(diǎn)瓊脂糖和普通瓊脂糖有什么區(qū)別？有什么用途？

 

制作瓊脂糖的原料通常是兩種海藻：Gelidium和Gracilaria。普通的瓊脂糖通常可以分離1～25Kb范圍的DNA片段，熔化溫度一般在85～90攝氏度，凝固溫度一般在40～42攝氏度。

 

對(duì)普通瓊脂糖進(jìn)行羥乙基修飾后，可以降低瓊脂糖的熔化溫度。有的熔化溫度甚至低至40～45攝氏度！

 

這么低的熔化溫度有什么意義和應(yīng)用呢？答案是低熔點(diǎn)瓊脂糖主要應(yīng)用于DNA的快速回收，想象一下，在比較低的溫度時(shí)，例如50～60攝氏度，低熔點(diǎn)的凝膠已經(jīng)熔化了，但這個(gè)溫度下DNA還是很穩(wěn)定，不會(huì)解鏈的。

 

因此，只需要進(jìn)行簡單的處理和升溫就能實(shí)現(xiàn)DNA的回收，而且這種回收得到的DNA還能直接進(jìn)行一些下游實(shí)驗(yàn)，例如細(xì)菌轉(zhuǎn)化。

 

（六）電泳緩沖液就是TAE buffer嘛？還有其他嘛？有什么區(qū)別？

 

其實(shí)，瓊脂糖電泳緩沖液有幾種，分別是TAE、TBE和TPE，不過常用的一般是TAE。下面就來看看這三種緩沖液有什么區(qū)別。

 

相同點(diǎn)：大家都是為電泳提供一個(gè)離子緩沖環(huán)境。

 

不同點(diǎn)：組份不同，對(duì)應(yīng)的緩沖能力不同，應(yīng)用場(chǎng)景也略有不同。我們具體來看看。

 

TAE：Tris-乙酸鹽+EDTA緩沖液組成；緩沖能力最弱，如果長時(shí)間的電泳，則不適合。其中一個(gè)標(biāo)志是長時(shí)間電泳后，凝膠的陽極一側(cè)會(huì)發(fā)生酸化，凝膠中的溴酚藍(lán)會(huì)從藍(lán)色變?yōu)辄S色。因此，TAE需要定期更換，才能保證電泳效果。

 

TBE: Tris-硼酸鹽+EDTA緩沖液組成；TPE：Tris-磷酸鹽+EDTA緩沖液組成；緩沖能力比TAE要高，DNA在后兩種緩沖液中的遷移速度較慢，適用于分離低分子量DNA的電泳實(shí)驗(yàn)。

 

（七）上樣緩沖液是什么？有什么用？

 

在正式電泳開始之前，常使用上樣緩沖液(loading buffer)來與樣品DNA混合，這種緩沖液在電泳時(shí)有什么用呢？

 

Loading buffer在瓊脂糖凝膠電泳中的作用主要有三個(gè)：

 

01 它可以增加樣品的密度，確保DNA樣品可以均勻沉入上樣孔內(nèi)；

 

02 Loading buffer含有顏色指示劑，除了幫助上樣時(shí)觀察樣品是否準(zhǔn)確加入孔內(nèi)

 

03 這種顏色指示劑主要由溴酚藍(lán)和二甲苯藍(lán)FF組成，它們兩者在電泳中會(huì)按照固定的遷移速度移動(dòng)，所以，我們還可以在電泳時(shí)通過Loading buffer幫助我們觀察條帶的遷移進(jìn)度

 

（八）電泳條帶看起來像個(gè)微笑的表情是什么原因？

 

最常見的原因是因?yàn)樯蠘恿刻罅?，常見的凝膠孔位的寬度是5mm，如果往里面加載的樣品超過0.5ug的話，就表明過量了。

 

最后，電泳時(shí)就會(huì)出現(xiàn)條帶兩側(cè)卷起彎曲（像微笑表情）、模糊不清、條帶拖尾的現(xiàn)象。DNA片段越大，這種現(xiàn)象會(huì)越明顯。

 

需要補(bǔ)充的一點(diǎn)是，并不是所有出現(xiàn)條帶拖尾的現(xiàn)象，都代表樣品量過載，也有可能是含有其他雜質(zhì)或樣品降解造成的。

 

（九）點(diǎn)樣孔內(nèi)出現(xiàn)很亮的條帶，且不動(dòng)，是什么原因？

 

DNA分子在電壓的推動(dòng)下，會(huì)向前移動(dòng)，但如果其分子量非常大，體積也就會(huì)變得很大，以至于無法穿過瓊脂糖向前移動(dòng)。

 

如果在基因組DNA提取后，樣本中含有蛋白質(zhì)，那么就很可能出現(xiàn)這種現(xiàn)象。其原因在于基因組中有大量的組蛋白和DNA纏繞在一起，如果提取過程中去除不干凈，這些蛋白就會(huì)和DNA一起進(jìn)入后續(xù)電泳中。

 

而蛋白在瓊脂糖電泳中，無疑是體積超標(biāo)了，因此整個(gè)孔內(nèi)的DNA也無法移動(dòng)出去。

 

參考資料：

https://www.labxchange.org/library/items/lb:LabXchange:a03c81b4:html:1

https://www.azolifesciences.com/article/Electrophoresis-An-Overview.aspx