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冷凍電鏡在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

冷凍電鏡技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中發(fā)揮了很大的作用，利用該技術(shù)能夠得到生物大分子的原子解析度結(jié)構(gòu)，從而能夠?qū)ζ溥M(jìn)行解析，這對(duì)于了解生命體的微觀活動(dòng)具有重要意義。具體來(lái)說(shuō)，冷凍電鏡主要用于對(duì)病毒、細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的微觀結(jié)構(gòu)、大分子復(fù)合物進(jìn)行高解析度剖析，如對(duì)病毒進(jìn)行三維重建。

對(duì)病毒進(jìn)行三維重建的研究有很多，其中一個(gè)范例是利用冷凍電鏡對(duì)哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒（mammalian orthoreovirus ，MRV）MPC/04株進(jìn)行三維重建。MRV可從很多哺乳動(dòng)物身體里得到，是無(wú)囊膜病毒的范例，對(duì)該病毒進(jìn)行研究能夠?qū)Σ《救肭帧?fù)制的過(guò)程和其致病的原理有一個(gè)更深入的了解。近年來(lái)由于生物科學(xué)尤其是冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)快速成熟，實(shí)現(xiàn)了能夠得到天然狀態(tài)下有著超高解析度的病毒的空間結(jié)構(gòu)，有關(guān)研究者通過(guò)冷凍電鏡技術(shù)中的單顆粒三維重構(gòu)的方法剖析了一株分離于果子貍的３型呼腸孤病毒的空間結(jié)構(gòu)。第一步要探究該種病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白的彼此影響方式，而后與已知的同源病毒結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行對(duì)比分析探討病毒結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成，深入探究病毒的入侵過(guò)程和病毒疫苗的研制。經(jīng)過(guò)艱苦的努力，研究者得到了具有完整結(jié)構(gòu)和較高純度的均一性良好的呼腸孤病株病毒粒子，利用冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)的方法第一次得到了解析度為９ Å的該病毒的空間結(jié)構(gòu)?并推斷出了該病毒σ１蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，初次剖析了其Ｎ端部分結(jié)構(gòu)。該項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)MPC/04株病毒和人源MRVT3D有著十分顯著的相似性。

冷凍電鏡技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用

技術(shù)進(jìn)步使得冷凍電鏡能夠分辨包括小分子的復(fù)合物等體積更小、分辨率更高的物體，大型動(dòng)態(tài)復(fù)合物和膜蛋白等不適合結(jié)晶的蛋白也得益于單顆粒冷凍電鏡的發(fā)展而有了其高分辨結(jié)構(gòu)。

1、膜蛋白GPCRs的研究

（1）G蛋白偶聯(lián)受體

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）是最豐富的細(xì)胞表面受體蛋白，并且被市場(chǎng)上30%的藥物所靶向2。盡管GPCR 的X射線晶體學(xué)研究取得了重大進(jìn)展，但由于需要獲得高質(zhì)量晶體和純化過(guò)程中相對(duì)較低的穩(wěn)定性，X射線對(duì)該家族的一些成員仍然難以應(yīng)付3。冷凍電鏡解決了以前構(gòu)象不穩(wěn)定且不能結(jié)晶的大復(fù)合物無(wú)法成像的問(wèn)題，并且可以確定 GPCRs的不同構(gòu)象以及與G蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，從而用于配體篩選或設(shè)計(jì)藥物。2016年，單顆粒冷凍電鏡解析了第一個(gè) GPCR的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（4.1 Å），確定了激活狀態(tài)下鮭降鈣素、G蛋白和人降鈣素受體（B類 GPCR）的異源三聚體結(jié)構(gòu)4。此后不久，結(jié)合兔胰高血糖素樣肽（glucagon-like peptide 1, GLP1）、G蛋白和 GLPI受體（B類GPCR）4.1 Å 的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)被解析，解釋了B類受體如何通過(guò)激素活化結(jié)合。人類GLPI受體結(jié)合的激動(dòng)劑和G蛋白異源三聚體的3.3 Å的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，給出了偏向激動(dòng)作用（biased agonism）的見(jiàn)解。最近這些 GLP1 受體結(jié)構(gòu)也被解析出來(lái)，打破了分子量為150kD時(shí)這種重要的藥物靶點(diǎn)幾乎不可能在近原子分辨率下使用冷凍電鏡成像的假說(shuō)。這些側(cè)鏈清晰可辨的結(jié)構(gòu)可幫助解決更高分辦率 GPCR 蛋白復(fù)合物的解析，同時(shí)也可幫助設(shè)計(jì)治療 II 型糖尿病和肥胖癥的新藥。

（2）Y-分泌酶

科學(xué)家嘗試將 Y-分泌酶作為潛在的藥物靶標(biāo)，因?yàn)閅-分泌酶不僅是早發(fā)性阿爾茨海默病患者身體中促進(jìn)患者大腦中淀粉樣斑塊形成的原因，同時(shí)在癌癥的形成方面扮演 Notch 信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)。在分辨率3.4 Å的y-secretase的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，四跨膜束內(nèi)核的兩個(gè)熱點(diǎn)突變削弱了蛋白酶活性，從而引起早發(fā)性阿爾茨海默病，這個(gè)原子模型可以幫助設(shè)計(jì)更具選擇性的化合物。值得注意的是，Y-secretase 糖基化對(duì)冷凍電鏡數(shù)據(jù)集的結(jié)構(gòu)重建幾乎沒(méi)有影響，而它卻可能妨礙X射線的結(jié)晶5。

（3）離子通道

在過(guò)去的4年里冷凍電鏡約解析出50個(gè)感受器電位（transient receptor potential, TRP）通道蛋白的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。TRP通道晶體由于其在細(xì)胞中基因表達(dá)水平低和對(duì)物化刺激敏感的特性，在歷史上獲得良好衍射的TRP通道晶體非常困難。結(jié)合激動(dòng)劑的瞬時(shí)受體電位香草受體 1（transient receptor potentical vanilloid subfamily member 1, TRPV1)（2.9 Å）6，TRPMI3（2.9 Å）7和 TRPM4（2.9 Å）8結(jié)構(gòu)是目前為止由冷凍電鏡解析的膜蛋白的最高分辨率結(jié)構(gòu)。與此同時(shí)，冷凍電鏡在研究大離子通道復(fù)合物方面也同樣做出巨大貢獻(xiàn)，如Ryano-dine 受體（RyRs）910 。這些解析出來(lái)的離子通道蛋白結(jié)構(gòu)，將成為藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)，同時(shí)也再次證明了冷凍電鏡技術(shù)的強(qiáng)大。

（4）ATP 結(jié)合蛋白（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

X射線衍射難以處理的其他膜蛋白復(fù)合物，冷凍電鏡同樣能夠給出其結(jié)構(gòu)。例如，解析并闡明真核 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multi-drug resistance-associated protein 1, MRP1）識(shí)別底物以及底物結(jié)合如何刺激 ATP 水解的機(jī)制11。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在多種藥物的吸收、分布、代謝和消除中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可導(dǎo)致藥物相互作用，因此，有關(guān)其結(jié)構(gòu)的信息可能對(duì)藥物開(kāi)發(fā)同樣具有重要價(jià)值。

2、抗體和疫苗

近年來(lái)，負(fù)染和冷凍電鏡已用于抗體的線性和構(gòu)象表位作圖以分析闡明單克隆抗體（mAb）的活性從而理解潛在生物治療劑作用機(jī)制。最近，Long12等使用冷凍電鏡闡明了病毒中和人 mAb 是如何結(jié)合病毒樣顆粒，并阻斷病毒和宿主膜融合的機(jī)制。Ciferri13等使用負(fù)染技術(shù)研究與 HTRA1（一種與年齡相關(guān)的黃斑變性有關(guān)的絲氨酸蛋白酶）形成獨(dú)特復(fù)合物并抑制其酶活性的抗體的結(jié)構(gòu)。該研究突出了IgG-HTRA1復(fù)合物的籠狀結(jié)構(gòu)，其較不緊湊的螺旋槳狀排列，具有比 Fab 對(duì)應(yīng)物更高的效力。最新的冷凍透射電鏡技術(shù)更可以通過(guò)表位作圖的方式對(duì)mAb 設(shè)計(jì)的輔助功能更上一層樓，冷凍電鏡技術(shù)關(guān)于促進(jìn)抗體和疫苗研究的報(bào)道還有很多，由此可見(jiàn)這類技術(shù)在藥物篩選方面的巨大推力。

冷凍電鏡在化工方向（鋰電池材料）中的應(yīng)用

鋰離子電池由正極、負(fù)極、集流體、電解質(zhì)組成，內(nèi)部存在各種界面，了解這些界面納米結(jié)構(gòu)如何隨電池工況的演變是電池研究中的難題，冷凍電鏡技術(shù)正好可以進(jìn)行應(yīng)用。

在快速冷凍下，電池材料就能保持原始的電化學(xué)狀態(tài)。斯坦福大學(xué)崔屹等人利用這一技術(shù)發(fā)現(xiàn)在兩種不同的電解質(zhì)中，鋰金屬表面上會(huì)形成兩種不同的界面納米結(jié)構(gòu)。Men等人利用冷凍電鏡觀察到了非晶態(tài)的鋰金屬結(jié)構(gòu)，Kourkoutis等人將冷凍電鏡與EELS相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)電池運(yùn)行過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的LiH，并成功繪制出電解質(zhì)中Li的液/固界面。固態(tài)電解質(zhì)薄膜對(duì)鋰離子電池的安全運(yùn)行至關(guān)重要，從正極溶解的金屬離子（例如Ni2+、Mn2+）會(huì)造成容量損失，借助冷凍電鏡和EELS技術(shù)，研究者就可以精確定位SEI中這些金屬離子的空間分布，并揭示負(fù)極相間結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的局部變化。鋰硫電池中的穿梭效應(yīng)會(huì)造成容量衰減，Nazar和崔毅等人利用冷凍電鏡技術(shù)研究了多硫化物在正極處的溶解過(guò)程，建立了SEI的結(jié)構(gòu)-性能的關(guān)系。

圖. 冷凍電鏡在電池材料中的應(yīng)用。（a）鋰金屬原子分辨率冷凍電鏡圖像和低溫傳輸過(guò)程示意圖；在不同電解質(zhì)中觀察到的（b）固態(tài)電解質(zhì)膜（SEI）和（c）多層SEI的冷凍電鏡圖像；（d）電子透明的低溫聚焦離子束抬升；（e）電池內(nèi)部固液界面處的冷凍電鏡圖像；（f）電子能量損失譜（EELS）顯示出界面處碳、氧和氟元素分布15

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[15]崔屹《ACS Nano》綜述：教你玩轉(zhuǎn)“冷凍電鏡”_騰訊新聞 (qq.com)