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摘要：抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）是一種新興的化療癌癥治療劑，它們結(jié)合了抗體的靶向特異性和小分子細(xì)胞毒性藥物的高效殺傷潛力。與它們的蛋白質(zhì)和小分子治療對(duì)應(yīng)物不同，ADCs的穩(wěn)定性和降解特性相對(duì)未知。理論上，ADC的穩(wěn)定性可能由來自抗體和連接子-毒素化學(xué)的屬性和過程所控制。最近，在主要文獻(xiàn)中提出了對(duì)ADC分子內(nèi)在穩(wěn)定性的系統(tǒng)性研究。由于工業(yè)和學(xué)術(shù)界正在努力開發(fā)下一代ADCs的優(yōu)化偶聯(lián)化學(xué)和抗體工程方法，因此捕捉對(duì)ADC穩(wěn)定性當(dāng)前理解的狀態(tài)非常重要。在這篇小綜述中，我們討論了從文獻(xiàn)調(diào)查中收集的ADCs的物理和化學(xué)穩(wěn)定性方面，并說明了穩(wěn)定性研究如何促進(jìn)未來更有效ADC分子的開發(fā)。

 

1.引言

 

抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）代表了腫瘤學(xué)治療領(lǐng)域的一類新型療法。這些混合分子結(jié)合了單克隆抗體（mAb）的位點(diǎn)特異性和小分子細(xì)胞毒性化合物的強(qiáng)大抗腫瘤效果。最初被認(rèn)為是Schofields的魔法子彈，這一愿景隨著Kadcyla和Adcetris兩種ADC產(chǎn)品最近獲得FDA批準(zhǔn)而逐漸成為現(xiàn)實(shí)，2014年的估計(jì)顯示有超過38種不同的ADC分子正在進(jìn)行實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)。Kadcyla由單克隆抗體Herceptin通過賴氨酸側(cè)鏈連接到細(xì)胞分裂抑制劑DM1。賴氨酸側(cè)鏈?zhǔn)紫仁褂苗牾啺?-(N-馬來酰亞甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽（SMCC）連接子轉(zhuǎn)化為活性形式。DM1分子末端的自由硫醇然后允許與馬來酰亞胺功能化的抗體偶聯(lián)。Adcetris由人鼠嵌合抗體cAC10通過半胱氨酸殘基連接到微管聚合抑制劑單甲基奧瑞司他丁E（MMAE）。首先對(duì)mAb進(jìn)行部分二硫鍵還原，以提供有限數(shù)量的自由硫醇用于隨后的偶聯(lián)。與單獨(dú)的mAb相比，ADC分子提供了一種潛在的更有效的形式，同時(shí)利用了高效細(xì)胞毒性劑的腫瘤殺傷活性。這些高效抗癌藥物的系統(tǒng)性給藥會(huì)帶來嚴(yán)重的毒性問題；因此，ADC平臺(tái)提供了一種靶向輸送系統(tǒng)，以擴(kuò)大這些藥物的治療潛力，否則這些藥物可能無法提供給患者。

 

盡管概念上是合理的，但由于結(jié)合了連接子和毒素化學(xué)（連接子載荷）以及由此產(chǎn)生的修飾位點(diǎn)的異質(zhì)性分布，ADCs比mAb或小分子成分要復(fù)雜得多。mAb本身的表征并不簡單，因?yàn)楸仨毐O(jiān)控許多關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）以確保最終產(chǎn)品接受。除此之外，表征是對(duì)藥物分子和藥物產(chǎn)品的長期穩(wěn)定性的深入理解。幸運(yùn)的是，治療性mAb的物理和化學(xué)穩(wěn)定性已經(jīng)得到了廣泛的研究，并且降解途徑與通常觀察到的其他蛋白質(zhì)一致。在單克隆抗體的開發(fā)過程中進(jìn)行表征和穩(wěn)定性研究，以了解物理化學(xué)負(fù)債，并建立控制策略，以確保適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量。

 

mAbs遇到的降解過程直接與ADCs相關(guān)，但除此之外，ADC與其mAb前體相比的化學(xué)和物理性質(zhì)的改變引入了在ADC藥物開發(fā)和制造過程中必須解決的額外穩(wěn)定性考慮。ADC、連接子載荷和mAb的不穩(wěn)定可能會(huì)影響分子的毒性、免疫原性和效力。ADC分子的制備涉及一系列激活、偶聯(lián)、緩沖液交換或其他處理步驟，以從mAb和小分子起始材料中產(chǎn)生ADC分子。

 

盡管這些步驟對(duì)成品ADC材料穩(wěn)定性的影響在主要文獻(xiàn)中才剛剛開始顯現(xiàn)，但下一代ADCs在開發(fā)和臨床管道中的密集管道顯然需要對(duì)ADC穩(wěn)定性的當(dāng)前狀態(tài)信息進(jìn)行評(píng)估。本文提供了對(duì)主要文獻(xiàn)中關(guān)于ADCs物理和化學(xué)穩(wěn)定性的獨(dú)特方面以及所使用的測(cè)量方法的當(dāng)前理解狀態(tài)的綜述。

 

關(guān)于物理穩(wěn)定性，學(xué)到的經(jīng)驗(yàn)可以應(yīng)用于不同偶聯(lián)方法的ADC格式。另一方面，化學(xué)ADC穩(wěn)定性研究主要集中在基于半胱氨酸或馬來酰亞硫醇偶聯(lián)上，因?yàn)樘囟ǖ慕到饣蚩赡嫘酝緩揭呀?jīng)詳細(xì)檢查。這些研究實(shí)現(xiàn)了提供更穩(wěn)定和均勻ADC分子的預(yù)期目的?；诎腚装彼峄蚬こ贪被岫皇琴嚢彼岬呐悸?lián)方法也在ADC穩(wěn)定性研究中占主導(dǎo)地位，因?yàn)檫@些技術(shù)產(chǎn)生的ADC分子具有較低的藥物載荷和較窄的分布，這些屬性已被確定為對(duì)治療窗口有益。

 

2.抗體藥物偶聯(lián)物的物理穩(wěn)定性

 

2.1.與偶聯(lián)過程相關(guān)的不穩(wěn)定性

 

ADCs的物理穩(wěn)定性和降解研究主要解決mAb聚集問題，以及由處理步驟或連接子和藥物修飾的物理影響帶來的聚集傾向增加。治療性mAb本身的聚集已經(jīng)得到了廣泛的研究，并為擴(kuò)展到ADCs提供了一些必要的理論和概念框架。在工業(yè)追求ADCs之前，已經(jīng)確定了硫醇修飾或IgG1抗體的部分還原對(duì)四元結(jié)構(gòu)和結(jié)合性質(zhì)的影響。首個(gè)獲批的ADC，Mylotarg，由卡利奇霉素衍生物ozogamicin與抗CD33抗體gemtuzumab偶聯(lián)。這個(gè)ADC代表了將疏水性小分子連接到大型親水性蛋白質(zhì)的困難。對(duì)于Mylotarg，偶聯(lián)需要高達(dá)20%的二甲基甲酰胺（DMF）以保持疏水性ozogamicin連接子載荷的溶解性。DMF的存在被證明促進(jìn)了過度的（高達(dá)約50%）聚集形成，通過尺寸排除色譜法（SEC）測(cè)量。甘油、丙二醇和辛酸等偶聯(lián)添加劑被證明可以減輕聚集問題，并允許在偶聯(lián)過程中使用較低的DMF濃度。

 

ADCs的聚焦物理穩(wěn)定性評(píng)估可能最初是在Trastuzumab（Tmab）、賴氨酸激活的Tmab T-MCC（使用SMCC激活）和完全偶聯(lián)的ADC分子T-DM1之間的比較中描述的。在一系列通過差示掃描量熱法（DSC）、SEC、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）和電泳分析的擴(kuò)展壓力穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，明確確定T-MCC和T-DM1比Tmab更容易聚集，聚集傾向的順序是T-MCC>T-DM1>Tmab。在DSC實(shí)驗(yàn)中，觀察到T-MCC、T-DM1和Tmab的可逆熱轉(zhuǎn)變；然而，T-MCC還展示了一個(gè)不可逆的成分，表明了聚集。在40°C下儲(chǔ)存7天后的SEC分析中也展示了聚集趨勢(shì)，其中在T-MCC中觀察到高達(dá)32%的高分子量物種（HMWS）的豐度。通過質(zhì)譜和電泳確認(rèn)了共價(jià)聚集作為這些T-MCC中HMWS的主要貢獻(xiàn)者。在添加游離氨基酸（Cys、Tyr、Ser）的情況下觀察到共價(jià)聚集的抑制，支持了T-MCC中游離暴露的馬來酰亞基團(tuán)能夠交聯(lián)的假設(shè)。這些發(fā)現(xiàn)說明了在處理馬來酰亞胺或其他活性化學(xué)物時(shí)控制副反應(yīng)的重要性。

 

Acchione等人使用差示掃描量熱法研究了賴氨酸連接、硫醇連接和糖基連接模型IgG1-生物素偶聯(lián)物的熱穩(wěn)定性。這項(xiàng)工作的一個(gè)主要觀察結(jié)果是，與賴氨酸連接相比，硫醇偶聯(lián)對(duì)抗體的破壞性影響更大。還觀察到，使用TCEP進(jìn)行的部分抗體還原對(duì)整體熱穩(wěn)定性的影響非常小，表明觀察到的穩(wěn)定性損失不是直接由于部分mAb還原。

 

2.2.溫度誘導(dǎo)或光誘導(dǎo)不穩(wěn)定性

 

典型的穩(wěn)定性測(cè)試策略在小分子和生物分子治療劑中使用，是通過提高溫度暴露來加速潛在不穩(wěn)定性問題的出現(xiàn)。Adem等人使用溫度和離子強(qiáng)度作為壓力條件，檢查每抗體高達(dá)8個(gè)偶聯(lián)藥物的硫醇連接MMAE藥物載荷增加的影響。通過制備性疏水作用液相色譜（HIC）分離出具有不同藥物-抗體比（DAR）的抗體偶聯(lián)物，允許檢查與MMAE逐漸增加的疏水性相關(guān)的效應(yīng)。高DAR組分的HMWS形成增加，在更高的離子強(qiáng)度條件下效果更加明顯。已經(jīng)建立了更高DAR與降低體內(nèi)性能之間的聯(lián)系。高DAR物種的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定化可能促成了體內(nèi)加速清除。Lyon等人最近對(duì)疏水性的檢查表明，通過親水性連接子設(shè)計(jì)或附加聚乙二醇（PEG）鏈（“PEG化”）獲得的更親水的auristatin ADCs可以提高效力。

 

Beckley等人使用多種光譜和分離工具檢查了隨DAR增加而誘導(dǎo)的溫度誘導(dǎo)聚集。具有不同DAR值的半胱氨酸偶聯(lián)ADCs在40°C下孵化，之后收集單個(gè)SEC分?jǐn)?shù)并通過DSC、遠(yuǎn)紫外圓二色光譜、電泳和反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析。綜合來看，研究表明DAR 6和DAR 8物種在壓力條件下更容易形成聚集體，SEC分析中觀察到的HMWS主要由DAR 6和DAR 8物種組成。更具體地說，DSC證據(jù)表明，由偶聯(lián)引起的CH2/鉸鏈區(qū)的部分展開是聚集形成的原因。

 

Guo等人最近對(duì)物理不穩(wěn)定性的檢查以高級(jí)光譜工具結(jié)合量熱學(xué)和分子建模進(jìn)行高階結(jié)構(gòu)分析。通過這些技術(shù)，與mAb相比，二級(jí)和三級(jí)ADC結(jié)構(gòu)的不可逆不穩(wěn)定化得到了精心確認(rèn)。

 

在處理和最終制造過程中，ADCs也間歇性地暴露于光線下。由于一些ADC載荷攜帶光吸收和光敏取代基，Cockrell等人在模型ADC系統(tǒng)中評(píng)估了光照暴露。通過SEC和動(dòng)態(tài)光散射分別觀察到ADC中的聚集體和顆粒形成，而在起始抗體或單獨(dú)的連接子載荷中沒有觀察到這些現(xiàn)象。

 

3.抗體藥物偶聯(lián)物的化學(xué)穩(wěn)定性

 

一般來說，mAbs或其他治療蛋白可能會(huì)發(fā)生許多潛在的化學(xué)降解途徑。尚未特別研究臨床上相關(guān)的連接子載荷對(duì)這些mAb降解過程的影響。然而，正如本節(jié)所討論的，已經(jīng)確定并研究了一些影響連接子-載荷穩(wěn)定性和偶聯(lián)穩(wěn)定性的ADCs的化學(xué)降解過程。

 

3.1.與偶聯(lián)過程相關(guān)的化學(xué)不穩(wěn)定性

 

ADCs的制造需要一些特定的工藝步驟將藥物部分偶聯(lián)到mAb上。對(duì)于賴氨酸和半胱氨酸偶聯(lián)，使用激活步驟以提供一定程度的位點(diǎn)特異性。激活和偶聯(lián)步驟本身涉及與活性劑的孵化期，有時(shí)在提高的溫度下（通常為37°C）。最終ADC制造還涉及額外的緩沖液交換、溶劑去除和濃度步驟。前面已經(jīng)描述了賴氨酸激活和偶聯(lián)以及溶劑暴露的一些潛在陷阱，與物理不穩(wěn)定性有關(guān)。特別是，賴氨酸激活步驟引入了激活物種交聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)?；诎腚装彼岬呐悸?lián)利用部分二硫鍵還原來生成控制數(shù)量的游離硫醇，這個(gè)過程本身引入了潛在的四元結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定化。其他mAb化學(xué)降解途徑也可能作為游離硫醇形成的間接后果而發(fā)生。Amano等人最近描述了IgG1的鉸鏈區(qū)半胱氨酸種族化在幾個(gè)月的儲(chǔ)存期間發(fā)生。這一觀察強(qiáng)調(diào)了mAb在處理過程中遇到的高溫和高pH暴露可能會(huì)促進(jìn)許多鉸鏈區(qū)氨基酸異構(gòu)化途徑。這些修飾最終影響mAb支架的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，包括結(jié)構(gòu)完整性和結(jié)合親和力。另一個(gè)潛在的問題是，如前所述，CH2/鉸鏈區(qū)不穩(wěn)定化與ADC聚集有關(guān)。

 

下一代ADC偶聯(lián)技術(shù)的目標(biāo)是通過使用眾多分子工程方法或通過新型化學(xué)方法的出現(xiàn)完全繞過控制二硫鍵還原步驟。Badescu等人描述了一種可能限制最終ADC分子中殘留游離硫醇存在的偶聯(lián)方法。這種方法源自于生成PEG偶聯(lián)蛋白的類似方法，首先在溫和條件下還原二硫鍵，然后引入雙功能試劑以啟用順序Michael加成/消除反應(yīng)。二硫鍵通過帶有PEG連接藥物載荷的3碳間隔子橋接。據(jù)報(bào)道，該反應(yīng)幾乎是定量的（95%），所得ADC在存在DTT的情況下抗還原且對(duì)解偶聯(lián)穩(wěn)定。該方法提供了一個(gè)更均勻的ADC藥物物質(zhì)，并限制了暴露游離硫醇的風(fēng)險(xiǎn)。最重要的是，安裝帶有連接子載荷或PEG基團(tuán)的3碳間隔子與原始二硫鍵形式相比沒有損害三級(jí)mAb結(jié)構(gòu)。

 

3.2.載荷釋放

 

在ADCs的背景下，對(duì)載荷本身的降解或直接釋放后偶聯(lián)的研究有限。通常，通過HPLC或LC-MS直接監(jiān)測(cè)制劑，載荷損失很小，例如Francisco等人在研究通過纈氨酸-瓜氨酸連接的cAC10基半胱氨酸偶聯(lián)物時(shí)觀察到的<2% MMAE損失在10天血漿孵化期間。Doronina等人通過直接檢查替代連接子化學(xué)，確認(rèn)了MMAE和auristatin E（AE）化合物在長期穩(wěn)定性試驗(yàn)中不會(huì)在緩沖液中或在存在人類肝臟溶酶體提取物或蛋白酶的情況下釋放。這些研究還證實(shí)，常用的腙連接子比蛋白酶敏感的纈氨酸-瓜氨酸連接子化學(xué)和生化穩(wěn)定性差。腙連接子的不穩(wěn)定性以及過早的ozogamicin載荷釋放被認(rèn)為是Mylotarg效力差的主要原因，該藥物在2010年被撤出市場(chǎng)。

 

在最近的研究中，使用單甲基auristatin D（MMAD）載荷的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)化學(xué)，觀察到MMAD的末端dolaphenine基團(tuán)在嚙齒動(dòng)物血漿中容易裂解。這種降解通過HIC和LC-MS/MS分析觀察到，發(fā)現(xiàn)這種反應(yīng)的程度取決于偶聯(lián)位點(diǎn)。重要的是，血漿中MMAD的裂解反應(yīng)也被發(fā)現(xiàn)是物種依賴的，在人類血漿中沒有觀察到ADC的可檢測(cè)降解，盡管在小鼠血漿中觀察到了對(duì)效力的明顯影響。已經(jīng)證明，通過賴氨酸激活SMCC連接子制備的偶聯(lián)物可以釋放高達(dá)5%-6%的游離藥物。在這種情況下，載荷釋放更與原始SMCC激活步驟的非預(yù)期副反應(yīng)有關(guān)，而不是直接的賴氨酸解偶聯(lián)。在HPLC和LC-MS實(shí)驗(yàn)中觀察到SMCC連接子與賴氨酸之外的半胱氨酸和酪氨酸側(cè)鏈反應(yīng)。所得的硫酯和酯鍵被證明比與賴氨酸胺形成的酰胺鍵不穩(wěn)定。

 

3.3.馬來酰亞胺-硫醇偶聯(lián)物中偶聯(lián)的可逆性

 

關(guān)于ADCs化學(xué)穩(wěn)定性的主要研究領(lǐng)域是關(guān)注連接子載荷與mAb上半胱氨酸的共價(jià)連接的穩(wěn)定性。最終，ADCs的設(shè)計(jì)是不穩(wěn)定的，它們會(huì)經(jīng)歷生化降解以釋放自由藥物，作為它們藥理學(xué)的一部分。在這篇綜述中，我們主要關(guān)注從化學(xué)、制造和控制的角度來看ADC藥物物質(zhì)的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。關(guān)于ADC藥理學(xué)的綜述，包括導(dǎo)致載荷釋放的細(xì)胞降解事件，已有提供，因此不在本次綜述的范圍之內(nèi)。制造半胱氨酸連接的ADC主要通過馬來酰亞胺-硫醇反應(yīng)化學(xué)進(jìn)行半胱氨酸偶聯(lián)。盡管通常被認(rèn)為是化學(xué)穩(wěn)定的生物偶聯(lián)方法，但有明確的證據(jù)表明這種偶聯(lián)是可逆的，當(dāng)ADC分子給藥并在循環(huán)中遇到游離硫醇時(shí)，這種可逆性就會(huì)顯現(xiàn)出來。這不是嚴(yán)格意義上的化學(xué)、制造和控制視角下的不穩(wěn)定性，但顯然已經(jīng)揭示了平衡現(xiàn)象的存在，這從整體ADC化學(xué)穩(wěn)定性的角度引起了相當(dāng)大的關(guān)注。

 

Alley等人直接研究了暴露于血漿中的ADC的馬來酰亞胺-硫醇連接的逆轉(zhuǎn)。在旨在評(píng)估通過硫醚連接形成的非水解穩(wěn)定連接的穩(wěn)定性的研究中，觀察到MMAF藥物釋放，并伴隨著血漿中連接子藥物與白蛋白的結(jié)合。使用基于MMAF的親和捕獲，通過LC-MS和肽圖技術(shù)確認(rèn)了修飾位點(diǎn)為白蛋白的Cys-34。這種白蛋白共價(jià)修飾的位點(diǎn)與其他系統(tǒng)性給藥的含有馬來酰亞胺的抗癌藥物的觀察結(jié)果一致。已經(jīng)報(bào)告了假定穩(wěn)定的親電蛋白修飾的可逆性；然而，直到最近，這種現(xiàn)象才在提高化學(xué)穩(wěn)定性的背景下進(jìn)行了檢查。硫醇-馬來酰亞胺偶聯(lián)物在中性pH下通過鉬酸鹽催化的水解形成水解的琥珀酰亞胺硫醚的亞胺基團(tuán)的水解已經(jīng)之前檢查過。

 

Baldwin和Kiick使用模型硫醇，包括巰基苯乙酸和谷胱甘肽，進(jìn)行了關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)，建立了硫醇-馬來酰亞胺可逆性的更全面視圖。使用NMR、HPLC和LC-MS，實(shí)驗(yàn)顯示了游離和偶聯(lián)硫醇形式之間的交換，但也存在一個(gè)額外的機(jī)制分支，導(dǎo)致形成穩(wěn)定的環(huán)開的琥珀酰亞胺形式的硫醇-馬來酰亞胺連接。分支程度觀察到取決于馬來酰亞胺的取代和可用于交換和捕獲的游離硫醇的濃度。

 

琥珀酰亞胺逆Michael反應(yīng)的基本機(jī)制在圖1中表示。一旦制造和純化，硫代琥珀酰亞胺偶聯(lián)物1與去偶聯(lián)的馬來酰亞胺2存在明顯的平衡。馬來酰亞胺2在循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的過量游離硫醇基團(tuán)存在下易于Michael加成，生成如圖3所示的共價(jià)加合物?；旧希绨椎鞍椎倪^量游離硫醇基團(tuán)的存在，推動(dòng)平衡向形成3的形成，以至于在溶液中沒有直接觀察到游離馬來酰亞胺2。還展示了從偶聯(lián)物1的慢分支途徑，通過這種方式形成了環(huán)開的琥珀酰亞胺硫偶聯(lián)物4。觀察到偶聯(lián)物形式4是一個(gè)抵抗進(jìn)一步水解的終點(diǎn)物種。

 

在曲妥珠單抗-MMAE偶聯(lián)物的額外研究中，建立了馬來酰亞胺可逆性的位點(diǎn)依賴性組成部分。使用位點(diǎn)定向突變體在Fc、輕鏈（LC）或重鏈（HC）域放置游離硫醇，Shen等人觀察到LC偶聯(lián)物在血漿孵化后DAR減少方面最穩(wěn)定。額外的半胱氨酸Fc突變體揭示了穩(wěn)定性是一個(gè)位點(diǎn)依賴性而不是域現(xiàn)象。重要的是，反映在DAR隨時(shí)間變化的穩(wěn)定性并沒有與游離MMAE濃度相關(guān)，這些濃度相對(duì)恒定。相反，如前所述，白蛋白對(duì)釋放的有效載荷的捕獲解釋了DAR損失。此外，通過LC-MS觀察到更穩(wěn)定的偶聯(lián)物具有額外的（+18）質(zhì)量單位，支持了水解琥珀酰亞胺環(huán)開在防止逆Michael反應(yīng)中的作用。

 

還提出了導(dǎo)致硫醚在硫醇-馬來酰亞胺偶聯(lián)物中降解的氧化過程。在這個(gè)過程中，不希望的細(xì)胞毒素釋放可能通過完全硫氧化形成自由硫酸鹽類似物發(fā)生，而部分氧化為亞砜可能解釋了在氧化過程中效力的保持。在維持低pH的重要性在硫醚連接的氧化研究中得到強(qiáng)調(diào)，并且在后偶聯(lián)ADC處理的背景下需要進(jìn)一步的氧化研究。

 

先前概述的硫醚可逆性實(shí)驗(yàn)體和在圖1中顯示的實(shí)驗(yàn)直接揭示了通過涉及DAR或游離載荷釋放的常規(guī)穩(wěn)定性試驗(yàn)不會(huì)觀察到的降解過程。最關(guān)鍵的化學(xué)穩(wěn)定性設(shè)計(jì)涉及使用血漿孵化，然后是親和捕獲和分離的ADC 40的表征，通過HIC進(jìn)行DAR分析和LC-MS進(jìn)行精確分子量變化的識(shí)別。這種類型的工作流程使研究人員能夠仔細(xì)研究馬來酰亞胺-硫醇可逆性問題，如果直接監(jiān)測(cè)游離藥物或游離連接子載荷將是不成功的。

 

 

圖1. 抗體藥物偶聯(lián)物特異性的主要化學(xué)降解途徑——馬來酰亞胺-硫醇反應(yīng)的可逆性說明。具有馬來酰亞胺功能的連接子-載荷與單克隆抗體（mAb）上的游離硫醇反應(yīng)，形成琥珀酰亞胺硫醚抗體偶聯(lián)物（1）。在純化偶聯(lián)物（1）后，與未偶聯(lián)的馬來酰亞胺（2）存在一個(gè)平衡狀態(tài)，以至于在循環(huán)中的過量親電物質(zhì)（X-SH），如白蛋白或谷胱甘肽，可以經(jīng)歷Michael加成形成共價(jià)加合物（3），導(dǎo)致抗體解偶聯(lián)。琥珀酰亞胺硫醚（1）也可以經(jīng)歷水解，形成不可逆的環(huán)開形式（4），這是一個(gè)穩(wěn)定的基團(tuán)，已被證明其在血漿中的半衰期明顯長于典型的mAb半衰期。

Dorywalska等人在MMAE不穩(wěn)定性研究中提供了ADC親和捕獲工作流程的最新演示，其中結(jié)合的MMAE分子的化學(xué)不穩(wěn)定性只有在從血漿中親和回收后才被識(shí)別出來。實(shí)驗(yàn)還揭示了與MMAE降解導(dǎo)致的效力損失相關(guān)的物種差異。更廣泛地說，這些基礎(chǔ)研究揭示了偶聯(lián)穩(wěn)定性和清除率、偶聯(lián)位點(diǎn)、整體DAR以及由此產(chǎn)生的觀察效力之間相互作用的更深層次的復(fù)雜性。也許最重要的是，這些發(fā)現(xiàn)有助于確定設(shè)計(jì)新一代更穩(wěn)定、更有效ADC的方法，這些ADC的制造復(fù)雜性有所降低。

 

3.4.馬來酰亞胺可逆性的潛在解決方案

 

針對(duì)馬來酰亞胺可逆性問題的主要解決方案是通過促進(jìn)永久性的琥珀酰亞胺環(huán)水解來顛覆逆Michael硫醇-馬來酰亞胺反應(yīng)。

 

最近發(fā)現(xiàn)，通過將溶液pH提高到9.2，可以在大約14小時(shí)內(nèi)將近100%地將環(huán)開形式（圖1，物種4）轉(zhuǎn)化。通過仔細(xì)的LC-MS實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了在LC和HC上的偶聯(lián)都可以同樣高效地轉(zhuǎn)化為水解的環(huán)開形式。還觀察到連接子類型影響了琥珀酰亞胺水解的效率，PEG連接子比馬來酰亞己酰連接子更容易轉(zhuǎn)化。在對(duì)自催化琥珀酰亞胺水解進(jìn)行更具體的檢查時(shí)，Lyon等人準(zhǔn)備了含有靠近馬來酰亞胺氮的伯胺取代基的連接子。發(fā)現(xiàn)一個(gè)氨基甲基取代基顯著增加了琥珀酰亞胺水解速率，以至于在中性pH下不到6小時(shí)內(nèi)就能實(shí)現(xiàn)近100%的轉(zhuǎn)化。這種轉(zhuǎn)化速率在LC和HC的偶聯(lián)上觀察到是相似的。進(jìn)一步的研究證實(shí)了電子吸引基團(tuán)在馬來酰亞胺N取代基上加速水解琥珀酰亞胺環(huán)開和穩(wěn)定化的作用。

 

傳統(tǒng)馬來酰亞胺化學(xué)的替代品代表了解決逆Michael問題的另一種方法。如前所述的二硫鍵橋接方法，作為保護(hù)游離硫醇免受不需要的副作用的一種方式，也繞過了馬來酰亞胺可逆性問題，因?yàn)樯傻呐悸?lián)物是通過3碳烷基橋與連接子載荷形成的。類似的二硫鍵橋接方法旨在提供位點(diǎn)特異性、均勻的ADCs也已出現(xiàn)。其他活性化學(xué)物提供了替代馬來酰亞胺靶向游離硫醇的選擇，如芳丙腈或取代苯并噁二唑甲烷磺酸酯。結(jié)合抗體工程方法代表了替代基于馬來酰亞胺的偶聯(lián)并提供位點(diǎn)特異性連接子-載荷附著的另一個(gè)方向。細(xì)菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶已被用于催化工程谷氨酸殘基與連接子-載荷分子末端的伯胺之間形成酰胺鍵。通過工程化含有目標(biāo)谷氨酸殘基的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別序列，實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)?？贵w也可以通過非天然氨基酸進(jìn)行位點(diǎn)特異性工程化，提供替代的生物正交化學(xué)反應(yīng)能力。這種方法最先進(jìn)的例子是使用對(duì)乙酰苯丙氨酸與auristatin衍生物形成肟鍵，或者使用工程化甲酰甘氨酸氨基酸與色氨酸功能化的載荷進(jìn)行Pictet-Spengler連接。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，這些方法繞過了馬來酰亞胺可逆性的具體問題，代表了下一代ADC優(yōu)化的一個(gè)進(jìn)步。然而，廣泛認(rèn)識(shí)到的是，抗體工程的更廣泛挑戰(zhàn)以及這些主要結(jié)構(gòu)修改可能帶來的不穩(wěn)定性尚未完全檢查。

 

4，ADC穩(wěn)定性分析的實(shí)驗(yàn)方法

 

4.1.用于ADC穩(wěn)定性分析的方法

 

藥物物質(zhì)和藥物產(chǎn)品的穩(wěn)定性直接與ADCs的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）相關(guān)，這些屬性必須在ADC開發(fā)成注冊(cè)產(chǎn)品期間進(jìn)行評(píng)估。這些研究中獲得的信息類型高度依賴于使用的方法，表1提供了最近ADC分析研究中使用的方法的概述。表1中包括了每種技術(shù)提供的與穩(wěn)定性相關(guān)的信息的代表性文獻(xiàn)示例。最近也對(duì)用于ADCs物理化學(xué)表征的一些技術(shù)進(jìn)行了回顧。由于ADCs是非常復(fù)雜的分子，通常需要通過兩個(gè)或多個(gè)技術(shù)使用適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來檢查穩(wěn)定性的特定方面。

 

 

 

通常，通過表1中的溶液光譜技術(shù)如圓二色性、紫外-可見、熒光或動(dòng)態(tài)光散射來檢查物理穩(wěn)定性。此外，DSC對(duì)于理解溶液穩(wěn)定性至關(guān)重要，而SEC與UV或MALS檢測(cè)是監(jiān)測(cè)聚集存在的重要工具。最后，ELISA通常用于確認(rèn)mAb支架的結(jié)合活性，因此也報(bào)告了溶液四元結(jié)構(gòu)。所有這些技術(shù)都允許在ADC分子的天然溶液狀態(tài)下進(jìn)行分析。這些方法的典型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是在通常應(yīng)用熱處理前后仔細(xì)記錄光譜模式。

 

可以通過幾種正交分離技術(shù)來分析ADCs以表征化學(xué)穩(wěn)定性問題。HIC已成為確認(rèn)半胱氨酸或相關(guān)偶聯(lián)物的DAR值的中心技術(shù)，其中連接子-載荷分子為ADC增加了顯著的疏水性。HIC分離后的分?jǐn)?shù)也可以以更制備的方式使用，以分離單個(gè)DAR物種進(jìn)行進(jìn)一步表征。某些形式的高性能LC-MS，如識(shí)別H2O的添加或丟失，可以提供更精確的分子量信息。此外，基于MS的技術(shù)（MS/MS）可以用來確認(rèn)偶聯(lián)或化學(xué)變化的主要位點(diǎn)，使用將ADC消化成肽段進(jìn)行序列分析的蛋白水解工作流程。質(zhì)譜和HIC也是觀察和表征硫醇-馬來酰亞胺可逆性的重要工具，當(dāng)與親和捕獲工作流程結(jié)合時(shí)。進(jìn)行還原和非還原SDS-PAGE的能力也提供了一個(gè)直接的工具來表征和定位ADC偶聯(lián)模式。最后，成像毛細(xì)管等電聚焦（icIEF）提供了一個(gè)機(jī)會(huì)，以確定降解ADCs的電荷狀態(tài)分布的變化。

 

4.2.與分析測(cè)量相關(guān)的穩(wěn)定性偽影

 

生物治療藥物的樣品準(zhǔn)備和分析表征通常需要破壞性條件，這些條件可能產(chǎn)生偽影降解特性。ADCs的一個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性是來源于連接子藥物的小分子雜質(zhì)含量。如前所述，就化學(xué)ADC穩(wěn)定性而言，直接的HPLC測(cè)定藥物分子本身的分析并不一定能揭示降解過程。有趣的是，最近有研究表明，來源于連接子藥物的物種分析因RP-HPLC分析過程中的降解而變得復(fù)雜。這些方法通常使用低pH、30-40分鐘的運(yùn)行時(shí)間、高含水量以及在30°C-40°C附近的柱溫度，所有這些條件都支持水解過程。通過在5°C-10°C下運(yùn)行測(cè)定、在稀釋溶劑中使用乙腈代替醇類，以及使用超高壓液相色譜進(jìn)行更快的分析，可以減緩RP-HPLC分析過程中連接子藥物的降解。在更精細(xì)的實(shí)施中，這些原理被應(yīng)用于使用在線二維分離技術(shù)對(duì)ADC樣品中的高分子量和低分子量物種進(jìn)行表征。在第一維色譜中，SEC分離了HMWS，如單體、二聚體和聚集體，并且還允許在穩(wěn)定的中性pH條件下從小分子物種中分離出完整的ADC。然后，SEC維度的分?jǐn)?shù)與RP-HPLC耦合，以更詳細(xì)地分析ADC穩(wěn)定性樣品中的低分子量物種。在電泳過程中也觀察到馬來酰亞胺-硫醇PEG偶聯(lián)物的解偶聯(lián)。在這種情況下，裝載前的短暫高溫處理步驟與降解相關(guān)。有人假設(shè)Tumey等人提出的氧化硫醚斷裂途徑可能是這一觀察結(jié)果的可能機(jī)制。建議使用較低的溫度（60°C），在SDS-PAGE裝載前進(jìn)行更長時(shí)間的預(yù)處理，以最小化硫醚斷裂。

 

5.結(jié)論

 

ADCs的化學(xué)和物理穩(wěn)定性表征仍處于早期階段。隨著新的偶聯(lián)和抗體工程方法的出現(xiàn)，ADC的開發(fā)和臨床管道將繼續(xù)增長。同樣，對(duì)穩(wěn)定性分析的健壯工具的需求也將增長。從這篇綜述中可以收集到許多寶貴的經(jīng)驗(yàn)。首先，從二級(jí)、三級(jí)和四元結(jié)構(gòu)的角度對(duì)ADCs的生物物理分析以監(jiān)測(cè)配方穩(wěn)定性才剛剛開始被探索。其次，使用ADCs的親和捕獲和體外血漿孵化后的色譜和/或LC-MS分析（或擴(kuò)展到其他復(fù)雜基質(zhì)）是一種巨大的轉(zhuǎn)化工具，將傳統(tǒng)的儲(chǔ)存化學(xué)穩(wěn)定性與體內(nèi)化學(xué)穩(wěn)定性聯(lián)系起來。最后，對(duì)馬來酰亞胺-硫醇反應(yīng)性和可逆性的應(yīng)用于基礎(chǔ)研究揭示了進(jìn)一步優(yōu)化ADC的機(jī)會(huì)，提供了具有改善穩(wěn)定性和效力的新一代分子。